1.3. Методы изучения регуляции клеточного цикла

Даже вышеприведенное краткое описание клеточного ци­кла (и митоза как его части) показывает, сколь много событий происходит всего лишь за 24-36 часов (составляющих обычную продолжительность цикла.

Очевидно, все это управляется на молекулярном уровне. Т. е. за, казалось бы, чисто морфологическими явлениями стоит некое множество молекул-регуляторов, которое воспринимает митогенные сигналы и затем последовательно инициирует стро­го определенные события.

Как же расшифровывалась такая сложная молекулярная «кухня»? Это достаточно интересно и поучительно, поэтому хотя бы очень бегло расскажем о соответствующих экспериментах.

Их можно поделить на три типа:

а) эксперименты по слиянию клеток,

б) изучение делений бластомеров,

в) исследования мутантов (в основном, дрожжей).

а) Эксперименты по слиянию клеток. Здесь используются клетки, растущие в культуре.

Вот наиболее характерный эксперимент: специальной обработкой добиваются попарного слияния клеток двух видов - одни находятся в G1-, а другие — в S-периоде цикла. (Для кратко­сти их будем обозначать соответственно G1 и S-клетки.)

Образующиеся химерные клетки содержат по два ядра, причем на момент слияния в одном (нз S-клетки) происходит синтез ДНК, а в другом (из G1-клетки) нет. Так вот, через не большое время синтез ДНК начинается и во втором ядре.

Следовательно, в S-клетке содержатся не­кие факторы, способные диффундировать в ядра G1-клеток и инициировать репликацию ДНК. Очевидно, это те самые факто­ры, которые вызывают переход клеток из G1-периода в S-период.

Но если аналогичный эксперимент произвести с G2- и S- клетками, то результат будет отрицательным: в G2-ядре (уже со­держащем удвоенный набор ДНК) репликация ДНК не начина­ется. Значит, в G2-ядрах имеется механизм, который блоки­рует избыточную репликацию даже при действии стимули­рующих факторов.

Весьма показательны также эксперименты с М-клетками (т. е. клетками, находящимися в митозе). В них нет ядерной обо­лочки. После же слияния с ними любых ннтерфазных клеток (G1-, S- или G2-клеток) ядерная оболочка последних также раз­рушается, а хромосомы подвергаются конденсации.

Это свидетельствует, во-первых, о том, что в митотических клетках присутствуют регуляторные факторы, запускающие митоз. Во-вторых, в отличие от синтеза ДНК, контроль над за­пуском митоза не столь жесткий, так что возможно прежде­временное вхождение в митоз (не только из G2-. но также из G1- и S- периодов). С этим обстоятельством могут быть связаны опре­деленные нарушения клеточного цикла.

б) Изучение делений бластомеров. В данном случае объектом исследования служили крупные яйцеклетки амфибий и морских ежей, а также образующиеся из них зародыши самых ранних стадий развития.

Как известно, на этих стадиях интенсивно происходят митотические деления, причем у зародышей амфибий (как и мор­ских ежей) все клетки делятся одновременно. Кроме того, ука­панные объекты удобны тем, что могут быть получены в доста­точна . больших количествах. Все это позволяет осуществлять i.биохимический анализ — фракционировать содержимое кле­ток, находящихся на определенной стадии цикла, и произво­дить очистку соответствующих белковых факторов.

А как проверить биологическую роль выделяемых факто­ров? Примерно так же, как это делалось в экспериментах предыдущего типа. А именно: ввести либо клеточный экстракт, либо определенную его фракцию в ооциты. покоящиеся в самом начале мейоза. Если в изучаемом образце содержатся факторы, запускающие деления, ооциты «просыпаются» и вступают в мейотические деления, превращаясь в яйцеклетку. Положительные результаты такого тестирования, между прочим, означают, что механизмы митотических и мейотическнх делений во многом близки.

Более того: оказалось, что данный тест можно использовать для оценки экстрактов из делящихся клеток не только самих амфибий, но и других животных, в т. ч. млекопитающих.

в) Исследования мутантов. Как уже отмечалось, в этих генетических экспериментах использовались, в основном, дрожжи. В вегетативной фазе жизнедеятельности их клетки га­плоидны (содержат по одной копии генов), что облегчает выяв­ление мутаций.

Мутации можно индуцировать разными способами: облучением, нагреванием, химическими агентами.

Такие исследования показали, что некоторые мутации на­рушают клеточный цикл. При этом характерным образом меня­ются размеры клеток.

При т. н. cdc-мутациях (от cell division cycle цикл де­ления клеток) блокировано деление клеток, отчего последние только растут в длину (не почкуясь) и достигают очень больших размеров.

Напротив, при т. н. wee-мутациях (wee — крошечный) деления происходят раньше времени — до того, как клетка ус­пела достаточно удлиниться; поэтому получаются клетки очень малой длины.

Выяснилось, что проявляться как cdc мутация могут пов­реждения разных генов: то одного, то другого, то третьего — и т. д. То же относится к мутациям wee. Следовательно, все эти ге­ны ответственны за регуляцию клеточного цикла.

А чтобы идентифицировать конкретный продукт каждого такого гена, поступают следующим образом:

- выделяют ДНК из нормальных клеток,

- фрагментируют ее с помощью рестриктаз,

-включают получающиеся фрагменты нормальной ДНК в состав различных плазмид

- и вводят плазмиды с испытуемым фрагментом в мутантные клетки.

Если мутация - рецессивная, а введенный фрагмент ДНК содержит «правильную» версию мутированного гена, то клеточ­ный цикл нормализуется и образуется колония клеток обычно­го размера. Так становится известным очередной ген, отвечаю­щий за клеточный цикл.

После этого сравнительно нетрудно выяснить природу бел­ка, который кодируется данным геном и является одним из ре­гуляторов цикла.

До сих пор речь шла лишь о генах н белках дрожжей. Но белки, регулирующие клеточный цикл, высококонсерватив­ны, т. е. сравнительно мало изменились за время эволюции. По­этому соответствующие гены даже человека, будучи введенны­ми с плазмидами в мутантные дрожжевые клетки, часто способ­ны восстановить у последних нормальный клеточный цикл.

Следовательно, данная модель подходит для изучения регу­ляторных генов и высших животных.