БХ Тема 3

Тема 3 Методи виділення та кількісного визначення білків. Складні білки.

Актуальність теми.

Сучасні методи виділення і фракціонування білків дозволяють відділити протеїни від інших клітинних структур і вивчити особливості їх складу, властивості, що відкриває широкі перспективи використання цих досліджень у медицині.

Детальне вивчення структурно-функціональних особливостей складних білків показало, що окремі їх представники беруть участь саме в ключових метаболічних процесах. Порушення функціонування таких білкових молекул призводить до патологічних змін в обміні речовин, які можуть мати небезпечні клінічні прояви.

Нуклеїнові кислоти становлять істотну небілкову частина нуклеопротеїнів. Крім важливої ​​ролі нуклеїнових кислот у зберіганні та реалізації спадкової інформації, проміжні продукти їх обміну - нуклеотиди, виконують регуляторні функції, контролюючи біоенергетику і швидкість метаболічних процесів.

Теоретичні знання про складні білки і методи їх дослідження можуть бути використані під час вивчення таких дисциплін, як патологічна фізіологія, фармакологія, клінічна біохімія.

Мета заняття

• Знати основні методи виділення і фракціонування білків

• Оволодіти методами кількісного визначення білків.

• Знати будову та класифікацію складних білків

• Уміти інтерпретувати наслідки структурно-функціональних змін складних білків

Конкретні цілі:

• Інтерпретувати результати дослідження білків за допомогою методів осадження, діалізу, ультрацентрифугування, хроматографії, електрофорезу.

• Пояснювати класифікацію та характеристику складних білків, значення окремих представників;

Теоретичні питання:

1. Методи виділення та очистки білків. Використання методів висолювання, діалізу, електрофорезу в технології одержання білкових препаратів.

2. Методи кількісного визначення білків.

3. Складні білки: класифікація, представники окремих класів, вміст в організмі людини.

4. Гемопротеїни: міоглобін, гемоглобін, цитохроми. Їх біологічні функції та структурні особливості.

5. Глікопротеїни: класифікація, особливості структури, поширення, біологічні функції. Істинні глікопротеїни і протеоглікани, хімічна будова, біологічна роль.

6. Ліпопротеїни, класифікація (ɑ-, β-, пре-β-ліпопротеїни, хіломікрони), біологічні функції.

7. Нуклеопротеїни.: хімічна будова, біологічна роль.

8. Нуклеотиди: будова, структурні компоненти, номенклатура, біологічна роль.

9. Вільні нуклеотиди: участь у метаболічних реакціях та їх регуляції. Циклічні нуклеотиди.

10. Нуклеїнові кислоти: особливості структурної організації, біологічні функції ДНК і РНК.

11. Фосфопротеїни: особливості будови та роль в організмі.

12. Металопротеїни: особливості будови та роль в організмі.

Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення білка в досліджуваному розчині шляхом вимірювання оптичної густини колориметричним методом (біуретова реакція).

Принцип методу. Біуретова реакція характерна для сполук, що містять у своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Метод заснований на здатності пептидних зв'язків білків утворювати з іонами Сu^{2 +} у лужному середовищі продукт фіолетового кольору, інтенсивність якого пропорційна вмісту білка в середовищі.

Хід роботи: У першу пробірку вносять 1 мл 0,9 % розчину натрію хлориду (контроль), у другу – 1 мл стандартного розчину білка (70 г/л), у третю пробірку – 1 мл досліджуваного розчину білка. Додають 1 мл 3% розчину лугу і 0,2 мл 1% розчину сірчанокислої міді (реактиву Бенедикта). Добре перемішують і через 15 хвилин фотоколориметрують на ФК, кювету 5 мм при зеленому світлофільтрі, довжина хвилі 540 нм. проти контрольного розчину

Розрахунок проводять за формулою: Х= ( С ´ А_д ) / А_ст,

де: Х – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л;

С – концентрація речовин у стандартному розчині;

А_д – оптична густина досліджуваного розчину;

А_ст – оптична густина стандартного розчину білка.

Пояснить отриманий результат. Зробить висновок.

Значення для фармації та клініки. Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколометричні та спектрофотометричні методи, у деяких випадках – фотонефелометричні методи, а також визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія).

У клініко-біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу захворювання проводять визначення концентрації білків у біологічних рідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У нормі вміст загального білка у сироватці крові становить у дорослих 65 – 85 г/л (6,5 – 8,5 %), у дітей до 6 років 56 – 85 г/л (5,6 – 8,5 % ).

Колориметричні методи визначення кількості білків базуються на „кольорових” реакціях на функціональні групи білків: біуретова реакція; мікрометод визначення кількості білка за допомогою реактиву Бенедикта; метод Лоурі; метод Лоурі в модифікації Святкіна (використовують для визначення вмісту білка в препаратах із підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів);

Ультраспектрофотометричний метод визначення кількості білка базується на здатності ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою – фенілаланіну білка поглинати ультрафіолетове світло з максимумом поглинання при 280 нм.

Визначення вмісту білка сироватки крові рефрактометричним методом, основаним на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення. Величина показника заломлення сироватки крові залежить, головним чином, від вмісту в ній білка. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри

.

Дослід 2. Розділення альбумінів і глобулінів методов висолювання.

Принцип методу: Висолювання – це зворотна реакція осадження білків великими концентраціями нейтральних солей лужних та лужноземельних металів: (NН₄)₂SО₄, NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄, органічними розчинниками (спиртом, ацетоном) за умов нетривалої дії і низької температури. Реакція висолювання зумовлена дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією його електричного заряду. Під час висолювання молекула білка зберігає свої нативні властивості, осад, що утворюється, можна знову розчинити у вихідному розчиннику.

Метод висолювання використовується для фракціонування суміші білків, наприклад, розділення альбумінів і глобулінів. Грубодисперсні білки – глобуліни – висолюються значно легше, ніж альбуміни, напівнасиченим розчином сірчанокислого амонію, тоді як альбуміни – насиченим розчином.

Хід роботи: У пробірку вносять 2 мл розчину яєчного білка, додають однаковий об΄єм насиченого розчину сульфату амонію і перемішують. В осад випадають глобуліни (50% насичення), які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. У фільтрат, в якому залишились альбуміни, додають кристалічний сульфат амонію до того часу, поки сіль перестане розчинятися. Спостерігають випадання в осад альбумінів (100% насичення), які мають відносно невелику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад альбумінів відфільтровують. Фільтрат перевіряють на відсутність білків за допомогою біуретової реакції. Осади альбумінів і глобулінів на фільтрі розчиняють в 3-5 мл води, щоб упевнитися, що висолювання має зворотний характер.

Намалюйте схему фракціювання білків. Зробить висновок.

Дослід 3. Незворотне осадження (денатурація) білків під впливом концентрованої азотної кислоти (проба Геллера)

Принцип методу: Під дією концентрованих мінеральних і органічних кислот відбувається денатурація білка внаслідок дегідратації та утворення комплексних солей білка з кислотами. У надлишку всіх мінеральних кислот, крім азотної, осад білка розчиняється. Тому реакція осадження концентрованою азотною кислотою лежить в основі кількісного визначення білка за методом Робертса-Стольнікова-Брандберга.

Хід роботи: На 1 мл концентрованої азотної кислоти обережно нашаровують 1 мл 1% розчину білка. На межі розділу двох рідин утворюється осад у вигляді білого кільця.

Пояснить отриманий результат. Зробить висновок.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біоорганічна хімія. — Вінниця: НОВА КНИГА, 2004. — 464 с.

2. Біологічна хімія: підруч. для студ. вищ. навч. закл./ Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, Н.М. Мадієвська та ін.. - Харків: Основа, 2000.- 678с.

3. Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження: підруч. для студ. вищ. навч. закл. О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило.- К.: Медицина, 2009.- 352 с.

4. Лекції, які читаються на кафедрі.

Додаткова:

1. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія .людини. Підручник .- Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с.

2. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. К.: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.

3. А. Ленінджер Основи біохімії - М., Мир, 1988.- в 3-х томах

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.