БХ Тема 6

Тема 6 Визначення активності ферментів в біологічних середовищах. Одиниці активності ферментів. Ензимопатії. Медична ензимологія.

Актуальність теми

Ферменти є біокаталізаторами з мінливою активністю, яка змінюється при певних регулюючих впливах. У клінічній практиці ферменти застосовують як фармпрепарати, а визначення їх активності у крові та сечі необхідно для діагностики патологічних станів.

Медична ензимологія є важливим розділом клінічної біохімії. Вивчення біохімічних аспектів медичної ензимології дозволяє створити цілісне уявлення про можливі ензимопатії, їх діагностику та лікування. По визначенню активності ферментів, ізоферментів у рідких середовищах організму, вивчаються особливості плину ферментативних реакцій в умовах патології. Отримана інформація може бути використана як у діагностиці, так і під час лікування.

Мета заняття:

• уміти визначати активність ферментів та інтерпретувати отримані результати.

• пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях.

Конкретні цілі:

• Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

• Характеризувати основи ензимопатологій, ензимодіагностики, ензимотерапії;

• Пояснювати механізм утворення множинних форм ферментів і переваги визначення ізоферментів у біооб’єктах.

Теоретичні питання

• Принципи визначення активності ферментів:

• за кількістю продукту, який утворюється під дією ферменту за одиницю часу,

• за кількістю витраченого субстрату за одиницю часу.

• Методи визначення активності ферментів та візуалізація результатів ферментативної реакції.

• Одиниці виміру активності та кількості ферментів: міжнародні одиниці, катал, питома активність ферменту.

• Основні аспекти сучасної ензимодіагностики. Клітинні, секреторні та екскреторні ферменти.

• Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів:

• інфаркт міокарду;

• захворювання печінки;

• захворювання м’язової тканини.

• Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів. Ізоферменти в ензимодіагностиці.

• Порушення перебігу ферментативних процесів: природжені (спадкові) та набуті ензимопатії, уроджені вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.

• Ензимотерапія – використання ферментів в якості лікарських засобів

• при захворюваннях травної системи;

• при гнійно-некротичних процесах;

• як фібринолітичні препарати;

• препарати ферментів.

• Використання інгібіторів ферментів в якості лікарських засобів:

• ацетилсаліцилова кислота;

• алопуринол;

• сульфаніламідні препарати.

• Іммобілізовані ферменти, їх характеристика, отримання і використання в медицині.

Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення активності амілази сечі за методом Вольгемута.

Принцип методу: метод ґрунтується на визначенні мінімальної кількості амілази, яка здатна розщепити задану кількість крохмалю протягом певного часу за стандартних умов. За одиницю активності діастази взята кількість, мл, 0,1% розчину крохмалю, яку може розщепити амілаза в 1 мл сечі при 37⁰С за 30 хв.

Хід роботи:

У 8 пробірок вносять по 1 мл 0,9% розчину NаСl. У першу пробірку додають 1 мл сечі, перемішують, відбирають 1 мл цієї суміші і переносять у другу пробірку. Вміст другої пробірки також перемішують, відбирають 1 мл суміші і переносять у третю пробірку і т.д. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об΄ємів у всіх пробірках. Отримують ряд розведень сечі, де концентрація ферменту в кожній наступній пробірці вдвічі менша, ніж у попередній (розведення сечі у 2, 4, 8, 16 і т.д. разів). Далі у кожну пробірку додають по 2 мл розчину крохмалю, перемішують і ставлять на 30 хв у термостат при 37⁰С.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1%-ний розчин йоду в 0,2 %-му розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”.

Показник	Пробірка
	1	2	3	4	5	6	7	8
Розведення сечі	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256
0,1% крохмаль, мл	2	2	2	2	2	2	2	2
Результат йодної проби

Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою, в якій сеча розведена у 16 разів. Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 мл сечі розщеплює 2 мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1мл сечі розщеплює - Х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки X = ^{1 × 2_} = ^{2 × 16} = 32 мл

^{1/16 1}

А отже: А (амілазна активність) = 32 одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності α-амілази у сечі використовують у клініці для діагностики захворювань підшлункової залози. Амілаза – один із екскреторних ферментів, які всмоктуються у кров з тонкого кишечника і виділяються із сечею як низькомолекулярні білки. Нормальні значення активності α-амілази сечі (діастази), яка визначена за Вольгемутом, варіюють у межах 16-64 одиниці.

При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо протягом першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми. При хронічних панкреатитах, раку підшлункової залози активність ферменту незначно підвищується. Деяке зростання активності амілази може супроводжувати паротит у дітей. При нирковій недостатності амілаза в сечі відсутня.

Дослід 2. Визначення активності холiнестерази в сироватцi кровi

Принцип методу: під дією холінестерази відбувається гідроліз ацетилхоліну до оцтової кислоти та холіну. Оцтова кислота спричиняє зменшення рН розчину, що призводить до зміни забарвлення індикатора.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що затратилась на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Пробірку заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірки
Сироватка крові, мл	0,5
2 % розчин ацетилхоліну,мл	1,5
Інкубація 10 хвилин у термостат при 370С.
Фенолфталеїн, крапель	2
Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування, мл

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна ацилхолінестераза (КФ 3.1.1.8), яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін (КФ 3.1.1.7).

У нормі активність холінестерази в сироватці крові становить 44,4 – 94,4 мккат/л (160-340 мкмоль/год∙мл) (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Оскільки холінестераза синтезується у печінці, гіпохолінестераземія спостерігається при захворюваннях печінки (злоякісних пухлинах, гострих та хронічних гепатитах), а також при кахексії, інфаркті міокарда, отруєннях фосфороорганічними сполуками. Підвищення активності холінестерази буває при гіпертонічній хворобі, виразці шлунка.

Література

Основна:

• Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

• Вороніна Л.М., Десенко В.Ф., Мадієвська Н.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа. – 608 с.

• Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

Додаткова:

• Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

• Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

• Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

• Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

• Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. – М.: Мир, 1980. – 364 с.

• Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с.