3 курс О / Осенний семестр / Учебные пособия, фармакопеи / ГЖХ, ВЭЖХ

71

2.1.4. Качественный и количественный анализы

Идентификацию веществ методом ВЭЖХ проводят по хроматограмме с учётом параметров удерживания компонентов (ранее рассмотрена в разделе “ Газожидкостная хроматография”) или по УФ-спектрам компонентов.

Например, идентификацию парацетамола в суппозиториях ректальных можно проводить следующим образом:

А. При остановке движения элюата снимают УФ-спектр анализируемого образца и сравнивают его со спектром стандартного образца. Совпадение полос поглощения спектров свидетельствует об идентичности анализируемых веществ (рис. 27).

Б. При прохождении анализируемого и стандартного растворов через кюветы УФ-детектора получают их хроматограммы. При совпадении времен удерживания делают вывод об идентичности веществ, входящих в анализируемые растворы (рис. 28).

В. Идентификацию веществ проводят, используя многоволновую (многоканальную) хроматографию по коэффициенту, рассчитанному из показателей абсорбции, измеренных при разных длинах волн (если позволяет детектор).

На рис.29 представлена многоволновая хроматограмма анализируемого раствора эналаприла малеата (таблетки 0,01 г).

На рис.30 представлена хроматограмма, полученная при анализе цитрамона, имеющего в своем составе парацетамол, кофеин, ацетилсалициловую кислоту. На хроматограмме изображены пики всех указанных ингредиентов и времена их удерживания, соответствующие стандартным образцам.

Количественное содержание индивидуальных веществ или каждого компонента в смеси проводят (см. раздел Количественный анализ, ГЖХ):

∙путем сравнения площадей пиков анализируемого и стандартного веществ, полученных в одинаковых условиях;

∙методом внутреннего стандарта;

∙используя градуировочный график.

ВПриложении 2 рассмотрено применение ВЭЖХ для испытаний на подлинность, растворение, количественное содержание некоторых лекарственных средств.

74

2,0

Кислота малеиновая

1,6

Эналаприл

1,2

O.E.

0,8

0,4

254 нм

214 нм

0,0

210 нм

Время, мин

Рис.29. Хроматограмма анализируемого раствора эналаприла малеата (таблетки 0,01 г) с УФдетектированием

∙путем сравнения площадей пиков анализируемого и стандартного веществ, полученных в одинаковых условиях;

∙методом внутреннего стандарта;

∙используя градуировочный график.

ВПриложении 2 рассмотрено применение ВЭЖХ для испытаний на подлинность, растворение, количественное содержание некоторых лекар-

ственных средств.

75

76

2.1.5. Современные жидкостные хроматографы

Рис. 31. Внешний вид и схема хроматографа «Милихром А-02»

Современные жидкостные хроматографы снабжены микропроцессором и устройствами, с помощью которых можно автоматически производить ввод пробы, поддерживать условия хроматографического процесса по заданной программе, автоматически оптимизировать условия разделения, проводить идентификацию и расчет количественного состава анализируемой смеси по одной или нескольким программам.

В настоящее время для анализов методом ВЭЖХ используют хроматографы серии «Милихром», фирмы «Hewlett Packard» и др.

Ниже представлены внешний вид и схема хроматографа «Милихром А-02» (рис.31), внешний вид хроматографа «Милихром 5»(рис.32),

.внешний вид и характеристики хроматографа «НР 1100» (рис.33).

77

Высокоэффективный микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» предназначен для работы в стационарных, мобильных или полевых лабораториях, выполняющих анализы качественного состава и количественного содержания веществ для различных отраслей промышленности, медицины, криминалистики, сельского хозяйства, охраны природы, науки.

Рис. 32. Внешний вид хроматографа «Милихром-5»

Комплектация и принцип работы жидкостного хроматографа «НР1100» (рис. 33).

1.Лоток для растворителей. Растворы из него подаются через дегазатор в колонку. Предусмотрены четыре рабочих склянки, снабженных стеклянными фильтрами Шотта.

2.Вакуум-дегазатор, где растворы освобождаются от растворенных газов, чтобы в колонке не образовались пузыри и застойные зоны, которые искажают форму пиков, а следовательно, и результаты анализа (из-за невозможности адекватно вычислить площадь под кривой).

3.В комплект прибора входят два насоса: градиентный и изократический. Градиентный насос в зависимости от заданных значений подает две или несколько жидкостей (он имеет четыре канала). Изократический насос смешивает их и подает далее в колонку.

4.Инжектор для ввода проб может быть ручной (шприц), автоматический или автосэмплер. При наличии последнего для исследуемых растворов имеются специальные флакончики вместимостью 2 мл, которые помещаются в лоток: место каждого флакончика пронумеровано от 1 до 100.

Специальное приспособление (держатель или захват) вынимает нужный флакон из гнезда, переносит его в отделение для ввода пробы, игла поднимается, флакон устанавливается на место, игла опускается во флакон, при этом отбирается заданное количество раствора. Держатель воз-

78

вращает флакон на место, а проба вводится в хроматографическую колонку.

Рис. 33. Внешний вид жидкостного хроматографа «НР 1100» фирмы

«Hewlett Packard»

5.Температура в данном приборе может задаваться и поддерживаться от 15 до 700С.

6.Введенная проба проходит через колонку; компоненты, если их несколько, разделяются и выходят из нее, а затем регистрируются де-

тектором.

7.В данном приборе предусмотрен УФ-детектор – спектрофотометр, имеющий проточную кювету и регистрирующий проходящие через нее вещества.

8.Управление прибором осуществляет компьютер, содержащий специальную программу «Chem Station».

В рабочем окне «Chem Station» имеется мнемосхема всего прибора: символическое изображение флаконов с образцами, инжектора, насоса, колонки в термостате, детектора, вычислительной системы и принтера.

Разработанные для исследуемой смеси условия хроматографического разделения заносят в специальные диалоговые окна, предусмотренные программой «Chem Station». При этом формируется метод (Method) и заносится в список методов. В дальнейшем при обращении к этому методу компьютер автоматически устанавливает все заложенные параметры.

Далее следует заполнение информации об образце (Sample info), т.е. название, номер серии, величина навески и т.п., которая хранится в памяти

79

компьютера и сводит к минимуму (либо вообще устраняет) ведение традиционного лабораторного журнала.

Полученные хроматограммы подвергаются аналитической обработке различными способами. Это могут быть вычисления с использованием градуировочных графиков или хроматограмм стандартных образцов, по которым определяется концентрация исследуемых образцов.

Результат анализа прибор представляет в виде так называемых отчетов (Report), которые по желанию могут содержать либо краткую информацию (Short Report) – хроматограмму и данные о полученных пиках: площади пиков, время удерживания и т.п., либо подробную информацию (Performance Report), включающую критерии разделения соседних пиков, число теоретических тарелок и т.п.

2.1.6. Альтернативный вариант традиционной ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография, являясь важнейшим методом фармакопейного анализа субстанций и лекарственных средств, вместе с тем остается одним из самых трудоемких, длительных и дорогостоящих. Так, например, анализ ампициллина по методике, описанной в Европейской фармакопее, занимает свыше 15 часов. Высокая чувствительность ВЭЖХ (как и ГЖХ) к любым изменениям параметров разделения – условиям эксперимента, материалов и аппаратуры – приводит к трудностям воспроизведения описанных методик. До сих пор действует следующий принцип разработки аналитических методик: “ каждому веществу своя методика анализа”, при которой устанавливается своя ” уникальная” процедура анализа, требующая использования “ своей” хроматографической колонки, “ своих” подвижных фаз, “ своей” методики градуировки хроматографа.

В качестве альтернативы традиционной ВЭЖХ ряд зарубежных токсикологов (S. Baker, M. Bogusz, S. Elliot и др.) и крупный российский специалист по жидкостной хроматографии Г.И. Барам предложили использовать принцип создания унифицированных методик анализа ряда соединений в одной и той же хроматографической системе (колонка с обращенной фазой, градиентное элюирование, УФ-детектирование). Идентификация пиков на хроматограмме исследуемого образца осуществляется путем сравнения их времен удерживания и спектральных характеристик в области УФ-спектра с параметрами, заранее полученными для стандартных веществ. Совокупность указанных параметров представляет собой “ базу данных”, а хроматограф, позволяющий осуществлять анализ с применением базы данных, получил название «ВЭЖХ-анализатор».