Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Сельскохозяйственная биотехнология. Практикум для СПО-1

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

08.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 12 / 72 3 4 5 6 7 > Следующая >>>

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

Приготовление питательных сред для культивирования

изолированных клеток и тканей растений

Теоретические основы

Общие навыки работы в стерильных условиях, основные практические аспекты получения культуры растительных клеток и тканей и ее поддержания группируются вокруг проблемы подбора подходящей среды для культивирования. Компоненты среды для выращивания растительных объектов in vitro условно можно разделить на 5 групп:

• макроэлементы;

• микроэлементы;

• источники углеводов;

• витамины;

• регуляторы роста.

Минеральная основа питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей должна включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, серу, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.).

Обязательным компонентом питательных сред является источник углерода и энергии (сахароза и глюкоза, обычно в концентрациях 20– 40 г/л). Полисахариды, как правило, не применяются, поскольку некоторые ткани, например опухолевые, содержат активные гидролитические ферменты (амилазу). Они могут расти на средах с растворимым крахмалом.

В состав большинства питательных сред для культивирования клеток и тканей растений входят витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновая кислота, пиридоксин, аскорбиновая кислота.

Содержание регуляторов роста обычно является определяющим фактором для успешного роста клеток растений. Наиболее часто используют ауксины и цитокинины.

Различия в потребностях в экзогенных ауксинах и цитокининах позволяют выделить несколько групп тканей:

• ткани, растущие на средах только с ауксинами (например, экс-

планты корня топинамбура, корней цикория);

• ткани, требующие для роста введение в среду только цитоки-

нинов (культура корешка белого турнепса);

• ткани, для роста которых необходимы и ауксины, и цитокини-

ны (большинство культивируемых тканей);

• ткани, растущие на средах с растительными экстрактами слож-

ного состава;

• опухолевые ткани, способные расти на средах без регуляторов

роста.

В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолилуксусную

кислоту (ИУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), нафтилуксусную кислоту (НУК) в концентрации 0,1–2 мг/л, 2,4-Д в концентрациях

менее 1 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. Для индукции каллуса обычно необходимы высокие концентрации ауксинов (чаще это 2,4-Д), при последующих пересадках их уменьшают. Студенты будут использовать вместо 2,4-Д – гетероауксин, а вместо ИУК, ИМК и НУК – корневин. Концентрация регуляторов роста указана на упаковке препарата.

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, БАП, зеатин. БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином.

Оптимум концентраций ауксинов и цитокининов, необходимых для роста культур клеток и тканей, у разных видов растений сильно варьирует. В каждом конкретном случае оптимальное их соотношение определяется экспериментальным путем.

Кроме ауксинов и цитокининов, отдельные питательные среды включают гибберелловую кислоту (ГК). Присутствие ГК в среде не является обязательным, но в некоторых случаях она стимулирует рост изолированной ткани, способствует образованию более вытянутых побегов.

Абсцизовую кислоту применяют при культивировании протопластов.

Гормоны необходимы для дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины (вызывающие клеточную дедифференцировку) и цитокинины (индуцирующие деление дедифференцированных клеток). В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов должно быть снижено или они могут быть полностью исключены. На средах без гормонов растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к гормонам связана со способностью этих клеток продуцировать эндогенные гормоны [5].

Для индукции первичного каллуса и реже для поддержания его роста в питательную среду иногда добавляют растительные экстракты или соки. Наибольшей ростактивирующей способностью обладает кокосовое молоко ‒ жидкий эндосперм кокосового ореха.

Для приготовления твердых питательных сред используют агарагар в конечной концентрации 6–10 г/л. Он представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Наименьшее количество нежелательных примесей содержит бактериальный агар (Bacto Agar). Обычно к среде добавляют 0,5–0,7 % бактериального агара [14].

С целью экономии времени растворы макросолей, микросолей, витаминов, фитогормонов готовят концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрация растворов макросолей должна быть больше необходимой в 10–20 раз, микросолей – в 100–1000 раз, витаминов – в 1000 раз. Маточные растворы хранят в холодильнике, причем для хранения витаминов и фитогормонов нужна отрицательная температура.

Большинство культур изолированных тканей растет на средах с рН 5,5–5,8. Обычно рН готовой среды устанавливается с помощью 10 %-го или 1 М раствора KOH или NaOH, или 1 М HCI перед автоклавированием. Однако надо учитывать, что после автоклавирования рН среды может снижаться в результате гидролиза сахарозы.

Для культивирования клеток, тканей и органов тех или иных растений используют питательные среды различного гормонального состава. Наиболее широко применяются среды Мурасиге – Скуга (табл. 2.1), а также Уайта, Гамборга и Эвелега (В5) [1]. Для проведения лабораторных работ с клетками, тканями и одревесневевшими черенками достаточно среды Мурасиге – Скуга.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Цель работы: освоить приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений (среда Мурасиге – Скуга).

Материалы, оборудование, реактивы: стаканы химические вместимостью 250 мл; колбы для хранения маточных растворов; мерные пипетки YF 1 и мерная колба на 10 мл; весы аналитические и ВЛКТ-500; электроплитка.

Для приготовления фитогормонов необходимы следующие реактивы: ауксины (гетероауксин), абсцизовая кислота (АБК), цитокини- ны (корневин), 0,5 М HCl, 0,1 M KOH, 0,1 % HCl, агар.

Последовательность выполнения работы

1. Приготовить 100 мл питательной среды Мурасиге – Скуга

(MC). Прежде всего необходимо приготовить маточные растворы

макро- и микросолей, хелата железа. Для приготовления хелата железа 25 г FеSО4 х 7Н2О растворяют в воде, добавляют в раствор 30,0 г триалона Б и КОН (5 %-й раствор) до pH = 5,5 и доводят водой до 1 л. Полученные маточные растворы сливают в емкости с притертой пробкой (хелат железа – в темной посуде) и с этикеткой, хранят в холодильнике при температуре 4 оС не больше месяца.

2. Концентрированные растворы витаминов готовят также с расчетом добавления 1 мл на 1 л среды, они должны быть разлиты по 10 мл и заморожены при –20 °С. Фитогормоны приготавливают в небольших количествах (10–20 мл) и хранят при 4 °С.

Ауксины (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота – 2,4-Д, индолил-

уксусная кислота – ИУК, 1-нафтилуксусная кислота, индолилмасля-

ная кислота и др.) и цитокинины (б-бензиламинопурин, кинетин, зеа-

.•

тин, 2-изопентенил-аденин) обычно используются в концентрации 10~7–10-5 М. Эти фитогормоны растворяют в нескольких каплях вод-

ного этанола или 1 н. NaOH и далее доводят до нужного объема бидистиллятом. Гиббереллин (GA3) легко растворим в воде. Концентрация гиббереллина и корневина указана на упаковке.

Для приготовления концентрированных растворов витаминов взять 10-кратные навески и растворить их в 10 мл воды; 1 мл содержит порцию витаминов, необходимую для приготовления 1 л питательной среды по прописи Мурасиге – Скуга (табл. 2.1). Хранить растворы во флакончиках из-под пенициллина в замороженном состоянии.

Таблица 2.1

Состав питательной среды Мурасиге – Скуга

Объем маточного

раствора

на л среды, мл

Компоненты

среды

Конечная

Концентрация,

концентрация

мг/л

в среде, М

NH4NO

KNO

CaCl

H2O

MgSO4 • 7H2O

KH2PO

H3BO

MnSO4 • 7H2O

ZnSO4 • 7H2O

Na2MoO4 • 2H2O

CuSO4 • 5H2O

CoCl2 • 6H2O

FeSO

7H2O

Na2ЭДТА. 2H2O

2,06 × 10

1,88 х 10

3,0 х 10 1,5 х 10

1,25 х 10

5 х 10 1,00 х 10 9,99 х 10 2,99 х 10 1,00 х 10 1,00 х 10 1,00 х 10 1,00 х 10 1,00 х 10

33000 50

38000 8800 7400

1240

Мезоинозит 2,06 х 10

Витамины

PP 2,06 х 10

3400

166

4460 1720

5 5560 5 7460

100000 1

500 B6 2,06 х 10 B1 2,06 х 10

Глицин 2,06 х 10

Сахароза 8,80 х 10

Агар-агар

500

1000 2000

30000

7000

3. Растворы фитогормонов приготовить следующим образом:

1) отвесить по 10 или 100 мг ауксинов (2,4-Д, ИУК, ИМК,

НУК) и абсцизовой кислоты (АБК), растворить в небольшом количестве этанола. Затем растворы довести дистиллированной водой до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл (1 мл содержит 0,1 или

1,0 мг гормона);

2) цитокинины (кинетин, зеатин, аденин, 6-БАП) (10 или

100 мг) растворить в небольшом количестве 0,5М НСl или КОН. За-

тем растворы довести дистиллированной водой до метки в мерной колбе вместимостью 100 мл (1 мл содержит 0,1 или 1,0 мг гормона).

На основе маточных растворов готовят питательную среду MС (табл. 2.1). В мерную колбу вместимостью 500 мл отвесить 15 г сахарозы, добавить 150 мл дистиллированной воды и после растворения сахарозы добавить 50 мл маточного раствора макросолей, 5 мл микросолей, 5 мл витаминов, 2,5 мл хелата железа. Содержимое мерной колбы довести дистиллированной водой до метки.

Необходимо обязательно измерить рН раствора, который устанавливают на уровне 5,6–5,8, используя 0,1 М КОН или 0,1 %-й раствор НСl. В предварительно нагретую среду (60–70 оС) добавить 3,5 г агара и довести до кипения, периодически помешивая.

Горячую питательную среду разлить в пробирки или чашки Петри примерно до 1/3 объема, закрыть ватно-марлевыми пробками или алюминиевой фольгой и стерилизовать в автоклаве.

Получаемые результаты

Студенты готовят маточные растворы макро- и микросолей, хелата железа (раствор FeSO4 и Na2 ЭДТА); концентрированные растворы витаминов; растворы фитогормонов. На их основе готовят питательную среду MС, разливают ее по пробиркам или чашкам Петри и стерилизуют.

Содержание отчета

Студентам необходимо ознакомиться с представленным теоретическим материалом и экспериментальной частью. Провести все тре-

буемые исследования, оформить отчет с указанием цели работы, основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы и полученных результатов.

Контрольные вопросы

1. Какие компоненты включают в питательные среды для культивирования

изолированных клеток и тканей?

2. Какие углеводы включают в питательные среды для культивирования

изолированных клеток и тканей и почему?

3. Какие гормоны включают в питательные среды для культивирования

изолированных клеток и тканей и почему?

4. Что добавляют в питательную среду для индукции первичного каллуса?

5. Что используют для приготовления твердых питательных сред и почему?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Получение культуры тканей из моркови

Теоретические основы

Морковь (Daucus carota L. var. sativus Hoffmn) является главной овощной культурой семейства зонтичных, широко возделываемой по всему миру (Леунов В.И., 2011). Эта культура имеет большое экономическое значение, так как возделывается на обширной территории, в 2012 году в мире было произведено 36 917 245 тонн моркови и репы [7].

Соответственно такие объёмы производства основываются на солидной базе семеноводства. Государственный реестр на 2013 г. включает 220 сортов и гибридов моркови, 103 из них – F1-гибриды, в основном зарубежной селекции. Большая доля F1-гибридов объясняется их высокой продуктивностью, товарностью, технологичностью [4]. Поэтому доля гибридных семян на рынке будет неуклонно увеличиваться.

Гибридная селекция моркови основана на двух системах ядерноцитоплазматической мужской стерильности: «brown another», «petaloid» и «gum».

Тип «brown another» характеризуется деформированными корич- невыми пыльниками, пыльца в которых отсутствует или нефункциональна из-за нарушений при прохождении мейоза. Этот тип является результатом взаимодействия «Sa»-цитоплазмы и двух независимых генов ядра, гомозиготным рецессивным aa и доминантным В. Гено- типы, содержащие два комплементарных гена Е и D, выступают в ка- честве восстановителей фертильности.

Мужская стерильность типа «petaloid» происходит от дикой формы Daucus carota L. и передана многим культивируемым сортам моркови. При наличии мужской стерильности типа «petaloid» пыль- ники полностью трансформированы в лепестки, и пыльца совершенно отсутствует. Деформация андроцея варьирует по степени и фенотипу, согласно чему было выделено несколько групп, таких как

«spoon», «strap», «carpeloid» [7].

Было высказано два предположения:

1) наследование данного типа происходит благодаря взаимодей-

ствию между Sp-цитоплазмой и двумя независимыми генами М1 и М2. Фертильные аналоги для данного типа в F1 не могут быть обнаружены из-за доминантного состояния гена М. Для обнаружения доминантных аллелей следует проводить анализирующие скрещивания с использованием мужски фертильного генотипа (Sp) m1m1 m2m2;

2) взаимодействие Sp-цитоплазмы и трех независимых генов, одного доминантного гена М и двух рецессивных генов ll и tt. Растения гетерозиготные по гену М могут проявлять частичную фертильность при повышенной температуре. Тем не менее данная гипотеза не дает исчерпывающего объяснения проявления данного типа стерильности [9].

Создание F1-гибридов моркови с использованием мужской сте-

рильности ведется на трехлинейной основе. Для создания трехлинейного гибрида необходима стерильная материнская линия, линиязакрепитель стерильности и фертильная отцовская линия. Для создания одной такой линии необходимо как минимум 12 лет. Так, в среднем на создание гибрида моркови при успешном ходе селекционного процесса может быть потрачено 16–20 лет [9].

Контролировать гибридизацию также возможно с помощью самонесовместимости, определяющейся как неспособность фертильного гермафродитного растения завязывать семена от самоопыления. Спорофитную систему самонесовместимости широко используют в селекции F1-гибридов разных видов капуст, редек [6].

Поскольку самонесовместимость растений не позволяет получить семена от самоопыления, то на помощь приходит микроклональное размножение, которое проводится путем непрямого эмбрио- и органогенеза в каллусной культуре и с использованием суспензионной культуры клеток. Для введения в культуру используются доступные типы эксплантов: ткани корнеплода после зимнего хранения, части цветущего растения (части стебля, листья, черешки листьев, части соцветия) [9].

Морковь – модельный объект многих исследований в области культуры тканей растений. Практически любую часть растения можно

успешно культивировать in vitro и получить регенеранты, если эксплант выделен на соответствующей стадии развития. Незрелые ткани и органы всегда более пластичны по способности к морфогенезу in vitro, чем зрелые ткани и органы. Более того, при выборе материала следует отдавать предпочтение меристематически активным тканям и органам, поскольку они удобнее при клонировании, легче выживают в культуре, обладают большей скоростью роста и тотипотентностью.

В качестве эксплантов наиболее подходящими являются меристемы, верхушки побегов, пазушные почки и незрелые, быстро растущие ткани. Зрелые листья, корни, стебли, черешки и части цветка также можно успешно культивировать, и из них образуются растения регенеранты путём органогенеза или соматического эмбриогенеза [5].

При культивировании тканей корнеплодов моркови следует учитывать, что рост тканей зависит от индивидуальных особенностей корнеплода даже в пределах одного сорта, выращенного в одинаковых условиях. Рост ткани зависит также от положения изолируемого экспланта по длине корнеплода (рис. 3.1). Обычно лучший рост наблюдается в том случае, если эксплант берется из верхней трети корнеплода. Расстояние от камбия также влияет на ростовую активность экспланта [6].

Рис. 3.1. Корнеплод моркови (Daucus sativus):

I – внешний вид; II – схема поперечного среза; 1 – перидерма; 2 – коровая паренхима;

3 – вторичная флоэма; 4 – камбий; 5 – вторичная ксилема; 6 – первичная ксилема;

7 – первичная флоэма (из Г.А. Бавтуто, Л.М. Ерей, 2002)

<<< < Предыдущая 12 / 72 3 4 5 6 7 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]