Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Экологическая токсикология. Практикум
.pdf
91
3.4 Работа №4. Влияние солей тяжелых металлов на активность
микроорганизмов почвы
Общие положения.
Одно из самых важных мест в почвенных экосистемах занимают
микроорганизмы.
Они являются последней ступенью в большинстве пищевых цепей, т.е. суть
редуценты.
Такие организмы, как плесневые грибки, используют в качестве пищи
органические вещества остатков от растений и животных, минерализуя их, делая
доступными для растений различные элементы. Тяжелые металлы могут сильно
ингибировать их активность.
Микроскопические грибы являются непременным компонентом большинства
наземных и водных экосистем. К ним относятся, в первую очередь, почвообитающие
микроскопические грибы, микромицеты-биодеструкторы, развивающиеся на
естественных и искусственных субстратах. Микроскопические грибы участвуют в
процессах круговорота многих химических элементов, в формировании гумусового
горизонта почвы, способствуют разрушению горных пород. Микромицеты
развиваются в экосистемах различных климатических зон в экстремальных условиях:
от вечной мерзлоты и участков с высоким уровнем радиации, до горячих источников.
Эти организмы существуют в водных системах морей и океанов и щелочных
водоемов; отмечаются в воздушной среде на высоте более 10 км. Многие из них
являются фитопатогенами, а также вызывают заболевания людей и животных.
Функции грибов в почвах:
- участвуют в процессах разложения органического вещества;
- играют важнейшую роль в процессах почвообразования;
- регулируют видовой состав, и функциональную активность других
организмов.
92
Грибы рода Aspergillus (рисунок 3.2), широко представленные в почвах,
хорошо растут на влажных образцах почв вв условиях постоянной температуры в
темных и затенённых местах, а также на на агаризованных средах, образуя
шерстистые, зернистые или пушистые колонии различных оттенков: белого,
зеленого, желтого, серого, коричневого и черного.
Рисунок 3.2 – Строение асперигилла
При микроскопии культуры виден септированный мицелий, от которого в
перпендикулярном направлении отходят характерные для этого рода конидиеносцы
с пузыревидным вздутием. На вздутии располагаются одноярусные или
двухъярусные конидиальные структуры (фиалиды), продуцирующие цепочки
округлых гладких или шероховатых спор. Известно более чем 150 видов аспергиллов.
В качестве возбудителей всех форм аспергиллеза различных локализаций в
литературе описаны A. alliaceus, A. candidus, A. clavatus, A.flavipes, A. glaucus, A.
japonicus, A. nidulans, A. sydowii, A. ustus и др. Основным этиологическим агентом
(до 90% случаев) считается A. fumigatus, на втором месте по выявляемости стоит
A.flavus.
Оборудование, реактивы, материалы.
93
Чашки Петри, цилиндры, пробирки, раствор соли тяжелого металла с
концентрацией 0,5 М, фильтровальная бумага, образец почвы.
Ход работы.
Из первоначального раствора соли тяжелого металла методом
последовательных разбавлений в пять раз готовятся растворы с концентрацией 0,1 М,
0,02 М, 0,004 М, 0,0008 М, 0,00016 М, 0,000032 М и воды в качестве контроля. 8 мл
этих растворов добавляются в чашки Петри, содержащие по слой почвы 0,5 см.
Поверх почвы накладывают кружок из фильтровальной бумаги. Чашки Петри
устанавливаются в темное место, и регулярно поверхность бумаги смачивается,
чтобы избежать высыхания. Эксперимент продолжается до тех пор, пока в
контрольном варианте желтая плесень грибков Aspergillus или темно-зеленая
Trichoderma не займут большую часть бумажного кружка. Тогда кружки бумаги
вытаскиваются, осторожно отмываются от комочков почвы. Плесневые грибки в ходе
своей жизнедеятельности выделяют различные окрашенные вещества, поглощаемые
бумагой, и по размеру окрашивание можно судить об активности плесневых грибков.
Изображение пятен переносится на кальку, и определяется площадь окрашивания.
На основании полученных результатов составляется график зависимости
активности микроорганизмов от концентрации тяжелых металлов в почве.
94
3.5 Работа №5. Влияние тяжелых металлов на активность водных
ракообразных
Общие положения.
Антропогенное воздействие на окружающую среду возрастает, количество
загрязняющих веществ увеличивается, и стандартные методы анализа природных
объектов (воды, воздуха и почвы) уже не справляются с поставленной задачей – их
результаты подчас очень трудно интерпретировать. Поэтому сегодня все более
популярными становятся методы биологического тестирования, когда в качестве
индикатора на присутствие в среде вредных биологически активных веществ
используют живые биологические объекты.
Водные экосистемы чрезвычайно чувствительны к повышенным
концентрациям таких токсических веществ, как тяжелые металлы. Пресноводные
планктонные ракообразные распространены повсеместно, обитают в заводях, лужах,
озерах, прудах, неглубоких водохранилищах. Являясь фильтраторами по типу
питания, рачки участвуют в процессах самоочищения водоемов. Поедая
одноклеточные водоросли, сдерживают цветение вод.
Род Daphnia имеет всесветное распространение (рисунок 3.4).
Рисунок 3.4– Внешний вид Daphnia
95
Дафнии в лужах, прудах и озёрах часто имеют высокую численность и
биомассу. Дафнии - типичные планктонные рачки, большую часть времени
проводящие в толще воды. Различные виды населяют мелкие временные водоёмы,
литораль и пелагиаль озёр. Довольно многие виды, особенно населяющие
засушливые районы, - галофилы, обитающие в солоноватых, солёных и
гипергалинных континентальных водоёмах. К таким видам относятся, например,
Daphnia magna, Daphnia atkinsoni, Daphnia mediterranea, a также большинство видов,
ранее относимых к роду Daphniopsis.
Большую часть времени проводят в толще воды, передвигаясь резкими
скачками за счёт взмахов вторых антенн, которые покрыты специальными
оперёнными щетинками (отсюда их обычное название — «водяные блохи», часто
относимое ко всем ветвистоусым). Многие дафнии способны также медленно ползать
по дну или стенкам сосудов за счёт токов воды, создаваемых грудными ножками
(антенны при этом способе передвижения неподвижны).
Основной пищей для дафний служат бактерии и одноклеточные водоросли.
Виды, которые переживают зиму в активном состоянии (в глубоких,
непромерзающих водоёмах), проводят её в придонных слоях воды, питаясь в
основном детритом. Питаются путём фильтрации, создавая токи воды ритмическими
движениями грудных ножек.
В прудах и лужах средней полосы России часто встречаются (и наиболее
популярны среди аквариумистов) следующие рачки рода дафния:
- большая дафния (Daphnia magna), самка - до 6 мм, самец - до 2 мм,
новорождённые - 0,7 мм. Продолжительность жизни - до 3 месяцев;
- обыкновенная дафния (Daphnia pulex), самка - до 3-4 мм, самец – 1-2 мм.
Живут 26-47 суток.
Данная работа иллюстрирует действие солей тяжелых металлов на активность
дафний.
Оборудование, реактивы, материалы.
Стаканчики, цилиндры, пробирки, раствор соли тяжелого металла с
концентрацией 0,5 М, популяция дафний.
96
Ход работы.
Из первоначального раствора соли тяжелого металла методом
последовательных разбавлений в пять раз готовятся растворы с концентрацией 0,01
М, 0,002 М, 0,0004 М, 0,00008 М, 0,000016 М, 0,0000032 М и воды в качестве
контроля. Эти растворы в количестве 200 мл наливаются в стаканчики, и туда же
помещаются дафнии в количестве по 50 рачков. В течении 3 дней наблюдают
изменения в поведении рачков, и записываются данные о выживаемости этих
животных.
Результаты оформляются в виде графика.
3.6 Работа №6. Влияние солей тяжелых металлов на гликолитическую
активность дрожжей
Общие положения.
Для оценки токсичности солей тяжелых металлов широко используют
различные эукариотические микроорганизмы.
Дрожжи являются одними из наиболее изученных биологических объектов.
Поэтому их удобно использовать и как объекты для токсикологии. Они быстро
размножаются. Их активность достаточно просто определить.
Дрожжи относят к одним из наиболее древних «домашних организмов». В 1680
году голландский натуралист Антони ван Левенгук впервые увидел дрожжи в
оптический микроскоп, однако, из-за отсутствия движения, не распознал в них живые
организмы. И лишь в 1857 году французский микробиолог Луи Пастер доказал, что
спиртовое брожение - не просто химическая реакция, как считалось ранее, а
биологический процесс, производимый дрожжами.
Дрожжевые клетки имеются всюду. Они питаются, вырабатывают энергию,
производят побочные продукты, размножаются. Дрожжи питаются сахарами, а в их
отсутствие - расщепляют крахмалы. Побочный продукт жизнедеятельности дрожжей
- углекислый газ, выделяющийся в виде крохотных пузырьков.
97
Этот процесс называется брожением. Размножаются дрожжи делением надвое
или почкованием (рисунок 3.5).
Рисунок 3.5 - Почкование дрожжей
Особенно перспективным объектом для биотестирования служат дрожжи S.
cerevisiae, которые являются одноклеточными микроорганизмами, обладающими
высокой скоростью роста. В то же время, у дрожжей, как у эукариотических
организмов, высокая степень гомологии клеточной организации и обмена веществ с
высшими эукариотами. Применяют дрожжи и для биотестирования тяжелых
металлов. Большинство биотестов основаны на определении цитотоксического и
генотоксического эффектов, на подавлении метаболической активности дрожжей.
Эти приемы биотестирования достаточно трудоемки, требуют специального
оборудования и особых условий. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae служат удобной
эукариотической моделью для определения токсичности наноматериалов, так как
обладают большой скоростью роста.
Оборудование, реактивы, материалы.
Стаканчики, цилиндры, пробирки, парафин, раствор соли тяжелого металла с
концентрацией 0,5 М, препарат дрожжей.
Ход работы.
98
Предварительно калибруются и выбираются пробирки с одинаковым
диаметром. Из первоначального раствора соли тяжелого металла методом
последовательных разбавлений в пять раз готовятся растворы с концентрацией 0,1 М,
0,02 М, 0,004 М, 0,0008 М, 0,00016 М, 0,000032 М и воды в качестве контроля. Эти
растворы в количестве 3 мл наливаются в пробирки. Стаканчики. Сухие дрожжи
распускают в воде, добавляют сахар из расчета 5 г/100 мл и добавляют в пробирки с
солями. Парафин расплавляют, и осторожно наливают в пробирки с дрожжами и
солями. Когда парафин застывает, он образует плотную пробку. Под пробкой
образуется анаэробная среда. В этих условиях дрожжи сбраживают сахар, образуя
этанол и углекислый газ. Объем выделившегося углекислого газа пропорционален
активности гликолиза. Через определенное, заранее определенное по контролю
время, измеряется величина подъема пробки, которая пропорциональна объему
выделившегося углекислого газа.
Результаты оформляются в виде графика зависимости подъема парафиновой
пробки от концентрации соли тяжелого металла.
3.7 Работа №7. Определение устойчивости клеток различных растений к
обезвоживанию серной кислотой
Общие положения.
В условиях жаркого сухого климата, а также городских экосистем явление
обезвоживания органов (и, соответственно, клеток) у древесных растений встречается
очень часто. Особенно это выражено на освещенных сторонах улиц, когда водообмен
затруднен из-за малого проникновения в почву осадков, а полив не производится. Это
явление выражается в потере тургора, колоколообразности листьев, пожелтении,
появлении некрозов.
Среди серосодержащих техногенных эмиссий наиболее фитотоксична двуокись
серы (SO
2
). Установлено, что SO2 является сильнодействующим ассимиляционным
ядом. В тоже время SO2 является местным ядом, убивающим только те участки
99
мезофилла листа, в которые он проник, не затрагивая, существенно,
жизнедеятельность соседних участков мезофилла. Это соединение адсорбируется на
поверхности растения, в основном на его листьях, и оказывает на него вредное
влияние. Диоксид серы, прежде всего, воздействует на клетки, которые регулируют
открывание устьиц. Степень их открывания в начальный период является основным
параметром, определяющим интенсивность воздействия загрязнителя. Попав в
межклеточное пространство листа, загрязняющее вещество вступает в контакт с
мембраной, окружающей клетку. При нарушении целостности этой
полупроницаемой мембраны нарушается баланс питательных веществ и процесс
поступления ионов. Пройдя в клетку, диоксид серы взаимодействует с
митохондриями и хлоропластами, в том числе и с их мембранами, что может привести
к весьма серьезным последствиям. Сернистый ангидрид в воздухе постепенно
окисляется до серного и растворяется в воде, образуя мельчайшие капельки серной
кислоты, повреждающей листья. Механизм фототоксического действия заключается
в неспецифическом нарушении деятельности многих ферментов вследствие
подкисления цитоплазмы и нарушения ионного режима. Наблюдаются нарушения
метаболизма органических соединений, фотосинтетических структур, происходит
накопление балластных токсических продуктов, транспортных путей миграции
энергии от хлоропластов к центрам их использования, появляются
автокаталитические цепные реакции свободно-радикального и фотодинамического
окисления. Токсичность сернистого газа значительно увеличивается с повышением
интенсивности освещения и в присутствии других загрязнителей – окислов азота и
озона.
Различают 2 группы повреждений, связанных с действием SO2:
- «видимые», выражающиеся в деформации, пятнистости и некрозах
ассимиляционных органов; и «скрытые», проявляющиеся в снижении
продуктивности за счет ингибирования фотосинтеза, изменении метаболизма,
увеличении восприимчивости к болезням и вредителям, ускорении старения
растений. При действии высоких концентраций газа четкие признаки поражения
проявляются через несколько дней. Хвоя приобретает рыже бурую окраску. У сосны
100
и пихты изменения окраски хвои часто начинаются с концов. Причем у сосны оно
протекает постепенно, тогда как у ели вначале идет медленно, а затем очень бурно.
На листьях под влиянием сернистого газа появляются пятна красно-бурого цвета
различного размера. Обычно поражаются края листовой поверхности, а центральные
зоны листа, примыкающие к осевой и главным боковым жилкам, остаются
здоровыми. При длительном воздействии сернистого газа подавляется рост растений,
в некоторых случаях отмирают верхушки побегов (рисунок 3.6).
а – на хвою сосны обыкновенной, б – на листья вяза приземистого
Рисунок 3.6 - Действие сернистого газа
Предлагаемая работа основана на свойствах серной кислоты обезвоживать
клетки листа, что часто встречается в условиях антропогенного загрязнения, когда
попавший через устьица в растение сернистый газ превращается в протоплазме
клетки в серную кислоту, вызывая потерю листом тургора, повреждение и гибель
клеток.
В другом варианте серная кислота, содержащаяся в воздухе городов, образует
туман из мельчайших капелек. Попадая на растение в больших концентрациях, она
вызывает ожоги, в малых - очень быстро проникает через устьица внутрь
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]