Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Физиология роста микроорганизмов. Учебное пособие для студентов специальности 050102 – «Биология» высших учебных заведений
.pdf
41
время удвоения числа клеток в культуре около 20 минут.
В некоторых случаях кинетика микробного роста линейна.
Тогда скорость прироста компонентов популяции постоянна:
dN = c (const) (8)
dt
или интегрируя N = cxt (9)
Линейной функцией здесь является число клеток и связано это с
ограниченным поступлением к клеткам некоторых компонентов
среды.
Рост бактериальных клеток связан с синтезом белка, одного из
важных компонентов клетки. Для синтеза белка необходимы азот т
углерод, также энергия. Рост бактерий представляет собой конечный
результат превращений, вследствие которых органический азот
окружающей среды переходит в органический азот цитоплазмы.
Молекулы белка слишком велики и потому не могут проникнуть
сквозь оболочку бактериальной клетки. Белки могут быть
использованы в качестве источника азота для роста бактерий лишь
только после расщепления до более мелких молекул, пригодных для
ассимиляции. Для этой цели бактерии выделяют внеклеточные
ферменты, которые осуществляют процесс расщепления.
8. Питательные среды
Выращивание (культивирование) микроорганизмов
используется в лабораторных и производственных условиях для
выделения, накопления и сохранения микроорганизмов.
Для культивирования микроорганизмов используют специальные
питательные среды, которые должны содержать необходимые
питательные вещества и являться оптимальной средой обитания
микроорганизмов.
В состав питательной среды обязательно входят 5 основных
элементов (С, Н2, О2, N, Р) и зольные элементы, микроэлементы,
количество воды не менее 60%. Универсальных сред, пригодных в
равной степени для всех микроорганизмов, не существует. В
закономерности от особенностей обменных процессов (фотосинтез,
способы получения энергии) отдельным видам микроорганизмам
требуются различные составы питательных веществ.
42
По составу питательные среды подразделяются на 2 группы:
- естественные
- искусственные.
Естественными называются среды, которые состоят из
натуральных пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство
из них применяют в виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют
сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для
изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов. Они
используются главным образом для поддержания культур
микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
Примерами служат мясо-пептонный бульон, почвенная вытяжка,
картофельная среда.
Искусственные среды (синтетические среды) – это среды, в
состав которых входят только определенные, химически чистые
соединения, взятые в точно указанных концентрациях.
Синтетические среды удобны для использования обмена
веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество
входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и
превращение.
Для разработки синтетических сред необходимо знать
потребности микроорганизмов в источниках питания и основные
особенности их обмена веществ.
В большинстве случаев синтетические среды готовят на
водопроводной воде и микроэлементы не добавляют.
К ним можно отнести: гидролизат казеина, дрожжевой
автолизат, кукурузный экстракт.
По назначению различают элективные и дифференциальнодиагностические среды.
Элективные среды обеспечивают развитие одного вида или
группы микроорганизмов и непригодны для развития других.
Элективные среды применяют главным образом для выделения
микроорганизмов из мест их естественного местообитания или для
получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды
позволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов
от других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы
позволить четко выявить наиболее характерные свойства
определенного вида.
43
Индикаторные среды применяются в клинической
бактериологии, при генетических исследованиях.
По физическому состоянию различают: жидкие, плотные,
сыпучие среды.
Жидкие среды широко применяют для выяснения физиологобиохимических особенностей микроорганизмов, для накопления
биомассы.
Плотные среды используют для выделения чистых культур
(получение изолированных колоний) для хранения культур,
количественного учета микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К
ним относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.
Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и
кремнекислый гель.
Агар-агар – сложный полисахарид, получаемый из морских
водорослей. Агар-агар удобен тем, что большинство
микроорганизмов не использует его в качестве питательного
субстрата, в воде агар-агар образует гели, которые плавятся при
1000С, а затвердевает при 400С. Поэтому на агаризованных средах
можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для
их роста температуре.
8.1. Требования, предъявляемые к питательным средам
1. В среде должны быть все необходимые для роста и развития
химические элементы.
2. Среда должна быть сбалансирована по химическому составу.
Это значит, что соотношение химических элементов питательной
среды и главным образом соотношение органогенных элементов –
С:N должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке.
3. Среды должны иметь достаточную
влажность,обеспечивающую возможность диффузии питательных
веществ в клетку. Для грибов эта влажность обеспечивается
содержанием влаги в субстрате не менее 12 %, для бактерий – не
менее 20 %.
4. Среда должна иметь определенное значение рН среды.Среди
микроорганизмов различают ацидофилы(кислотолюбивые
микроорганизмы), алкалофилы(щелочелюбивые микроорганизмы) и
нейтрофилы (лучше всего растут в нейтральной среде с рН около
44
7,0). К ацидофилам относятся грибы и дрожжи. Большинство
бактерий – нейтрофилы, для которых активная кислотность среды
около 4 ед. рН является губительной. Следует помнить, что при
стерилизации среды и в процессе культивирования микроорганизмов,
кислотность среды может сильно изменяться. Во избежание
изменения рН в среду добавляют буферные системы (например:
фосфатный буфер), СаСО3 (для нейтрализации образующихся в
результате культивирования органических кислот), вещества
органической природы, обладающие буферными свойствами
(например: аминокислоты, полипептиды, белки) и др.;
5. Среды должны быть изотоничнымидля микробной клетки,
т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри
клетки.
6. Среды должны обладать определенным окислительно-
восстановительным потенциалом (rh2), определяющим насыщение ее
кислородом. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить
любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор
обозначают rh2= 41, насыщенный водородом rh2= 0. Облигатные
анаэробы размножаются при rh2 не выше 5, аэробы – не ниже 10.
7. Среды должны быть стерильными, что обеспечивает рост
чистых культур микроорганизмов.
8.2. Количественный учет микроорганизмов
Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного
вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения
чистых культур микроорганизмов основаны на изоляции одной
микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем
выращивании потомства этой клетки на питательных средах
изолированно от других видов.
Наиболее распространенным способом выделения чистых
культур является посев смеси микробов на плотные питательные
смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые
считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще
используют агаризованные среды в чашках Петри. Основной задачей
метода является разведение концентрации микроорганизмов в
исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на
питательную среду выросли изолированные колонии. Существуют
два основных метода разведения исследуемого материала:
45
1) на поверхности плотной питательной среды;
2) предварительное разведение материала в физиологическом
растворе.
Метод на поверхности плотной среды используется для
выделения чистых культур аэробныхи факультативно - анаэробных
микроорганизмов. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с
плотной средой. В первую чашку наносят исследуемый материал и
распределяют его по поверхности шпателем. Затем производят посев
последовательно на поверхность среды в остальных чашках.
Количество материала,внесенного в среду, при этом
последовательно убывает. Метод предварительного разведения
используется для выделения чистых культур микроорганизмов, как
аэробных, так и анаэробных. Готовят разведение материалов 10-100
раз и более и производят посев разведений, пользуясь поверхностным
или глубинным методом.
Выделение чистых культур строгих анаэробов требует условий
выращивания без доступа кислорода.
1. Морфологические свойства – форма клеток, размеры,
подвижность, способность к образованию спор, возраст культуры и
др.
2. Культуральные свойства микроорганизмов устанавливают по
особенностям роста на питательных средах. На жидкихпитательных
средах отмечают: характер распределения культуры в жидкости
(равномерное, придонное или поверхностное), мутность сред, вид
пленки, осадка. На плотных питательных средах исследуют характер
колоний. Различают поверхностные и глубинные колонии. Отмечают
форму, профиль, блеск и цвет.
3. Физиологические свойства микроорганизмов обусловлены
ферментативной активностью: отношение к кислороду (тип дыхания),
тип роста (рост у дна пробирки, рост шляпкой вверх, рост
равномерный по всей длине укола).
4. Протеолитические свойства (способность расщеплять
белковые вещества) определяют по выделению из питательной среды
газов -продуктов расщепления белка.
Чтобы определить общее количество микроорганизмов в
различных субстратах, выявить и учесть численность представителей
отдельных групп и видов микроорганизмов применяют следующие
методы:
46
1) прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на
фиксированных окрашенных мазках);
2) выделение и учет высевом на плотные среды;
3) выделение и учет высевом на жидкие среды (метод предельных
разведений).
Методы прямого подсчета клеток под микроскопом дают
возможность учесть численность микроорганизмов в субстрате
полностью. Но при этом определяются всеживые и мертвые клетки. И
подсчет может быть не точным. Этот метод не дает представления,
какие процессы происходят в субстрате. Методами высева на
плотные и жидкие среды учитываются только жизнеспособные
клетки микроорганизмов.
8.3. Получение микробных препаратов-стимуляторов и
регуляторов роста
Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделяют
на свободноживущие в природных условиях и на симбиотические с
растениями и другими микробами.
К свободноживущим относят азотобактерии, актиномицеты, к
микробным симбионтам–азотоспириллы, симбионты бобовых
растений.
Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно 18 х
107 т молекулярного азота из воздуха, из которых 15% приходится на
цианобактерии.
К микробным стимуляторам и регуляторам роста относят гиббереллины, фузикокцин, ауксины.
К удобрителям почв можно отнести ризотрофин. Представляет
собой торфяную основу, смешанную с ризобактериями.
Технологический процесс включает подготовку клубеньковых
бактерий и получение инокулята. Инокулят готовят в условиях
умеренной аэрации на средах, содержащих растительные экстракты и
дополнительно вводят неорганические соли фосфаты и карбонаты.
Накапливают 5 млрд. клеток в 1 мл. Такую суспензию вносят в “
кислый” торф при 10-15 С. Торф до “обсеменения” бактериями
должен быть гомогенным, подсушенным, увлажненным. В
подготовленный торф вносят 50 мл суспензии бактерий,
перемешивают во вращающем барабане и сохраняют до полугода при
5-10С.
47
Как регуляторы роста применяется в промышленности.
Гиббереллиновая кислота синтезируется микромицетом, относится к
группе растительных гормонов сложного химического строения.
Образование и накопление гиббереллинов - процесс занимает до 15
суток.
Питательные среды для выращивания содержат 6% глюкозы,
глицерина, 0,7% соли аммония, 0,3% неорганический фосфат,
микроэлементы. Выход гиббериллинов - 200 мг/л культуральной
жидкости.
Фузикокцин–относят к регуляторам роста растений
гормонального типа. Он индуцирует корнеобразование у многих
древесных и плодоягодных культур, стимулирует прорастание семян,
моркови. Фузикокцин образуется грибом. Продукт получают при
глубинной ферментации в периодическом режиме на средах с
глюкозой или сахаразой и соевой мукой. Затем экстрагируют
хлороформом из культуральной жидкости, сорбируют
активированным углем, кристаллизируют.
48
9. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА
МИКРООРГАНИЗМЫ
9.1. Действие физических факторов на микроорганизмы
Рост, развитие и жизнедеятельность микроорганизмов зависит от
условий окружающей их среды. К факторам окружающей среды
относятся:
1. физические (влажность, температура, концентрация веществ
в среде, лучистая энергия)
2. химические (рН, действие некоторых органических кислот,
антисептики)
3. биологические (взаимоотношения микроорганизмов с
другими организмами).
Влажность среды
Гидрофиты –бактерии, дрожжи, грибы — условия влажности 98–
100 %. Мезофиты –плесневые грибы (Penicillium, Aspergilius), условия
влажности 92–96 %.Ксерофиты – (некоторые виды Aspergilius),
условия влажности 70–90 %.
Водная активность – отношение давления водяных паров раствора
(субстрата) Р и чистого растворителя (воды) РО при одной и той же
температуре. Водная активность выражается величинами от 0 до 1 –
абсолютно обезвоженное вещество, 1 – дистиллированная вода) и
характеризует относительную влажность субстрата. Рост
микроорганизмов наблюдается при значениях водной активности от
близких к 1,0 и примерно до 0,65. В пределах 0,99–0,98 находится
водная активность скоропортящихся продуктов. Большинство бактерий
не развивается при водной активности ниже 0,94.
Температура окружающей среды.
Каждый микроорганизм развивается только в строго
определенных температурных границах.
Кардинальные температурные точки: минимум, оптимум и
максимум.
Психрофилы 5–10 °С 10–15 °С 25 °С
Мезофилы 5–10 °С 25–35 °С 45–50 °С
Термофилы 25–30 °С 55–65 °С 70–80 °С
К термофилам и психрофилам в основном относятся бактерии.
Отношение микроорганизмов к температурам, превышающим
49
максимальную для их развития, характеризует их термоустойчивость.
Она очень различна у разных видов. Также она меняется в
зависимости от свойств среды (рН, концентрации веществ и др.).
Пастеризация, стерилизация, охлаждение, замораживание –
основные способы обработки пищевых продуктов.
Концентрация растворенных веществ
В нормальных условиях внутриклеточное осмотическое
давление должно быть выше, чем в питательном субстрате
(продукте). Клетка пребывает в состоянии тургора. При повышении
концентрации субстрата (за счет соли, сахара) цитоплазма клетки
теряет воду, сжимается (плазмолиз) и клетка может погибнуть.
Концентрация NaCl в 3 % может подавлять развитие гнилостных
бактерий (главным образом грамотрицательных, палочковидных).
Кокки, бациллы, клостридии более устойчивы (до 6–10 %).
Кроме того, существуют галофилы, которые делятся на
факультативные (условные) и облигатные (строгие). Условные
галофилы, или солеустойчивая группа, –бациллы, клостридии, кокки,
дрожжи, плесени. Галофил Staphylococcusaureus хорошо развивается
в средах, содержащих 10–15 % поваренной соли. Облигатные
галофилы солелюбивые, не растут в отсутствие соли (при
концентрации ниже 12 %), например, Halobacterlumsohnanum–
образует красный пигмент на соленой рыбе. Осмофильные дрожжи
развиваются при высоких концентрациях сахара.
Лучистая энергия
Солнечный свет – необходим фототрофам, остальные виды лучше
развиваются в темноте. Инфракрасные лучи оказывают только тепловое
действие, ультрафиолетовые лучи –вызывают фотохимические
изменения в молекулах субстрата клетки. Эффективность зависит от
дозы, характера облучаемого субстрата, его рН, температуры, степени
обсемененности и видового состава микрофлоры. УФ-лучи
применяются для обеззараживания питьевой воды воздуха
лабораторий, лечебных и производственных помещений, холодильных
камер и т.д. В течение 6 часов может быть уничтожено до 80 %
бактерий и плесеней, находящихся в воздухе.
Радиоустойчивость различных микроорганизмов колеблется в
широких пределах. Для вегетативных клеток бактерий губительная
доза лежит в пределах от 10 тыс. до 300 тыс. рад. Чувствительны к
50
облучению кишечная палочка, протей, сальмонеллы, Pseudomonas.
Более устойчивы микрококки, споры бактерий, дрожжи (дозы от 500
тыс. до 1 млн. рад). Радуризация – частичное уничтожение
микрофлоры на пищевых продуктах (в т.ч. плодах, овощах, ягодах)
путем обработки гамма-лучами. При этом увеличиваются сроки
хранения.
Эффективность действия ультразвука зависит от природы
организмов, частоты колебаний и других факторов. Шаровидные
микробы (кокки) более устойчивы, чем палочковидные. Также
достаточно устойчивы дрожжи (ложные), особенно устойчивы споры
бацилл.
Реакция среды (рН)
Жизнедеятельность микроорганизмов возможна лишь в
определенных границах рН. Для грибов и дрожжей характерна
слабокислая среда рН= 4,5–5,5. Большинство бактерий существуют в
диапазоне рН = 6,8–7,3, т.е. нейтральной или слабощелочной.
Плесневые грибы могут развиваться в широком диапазоне рН (1,2–
11,0). Кислая среда более губительна, чем щелочная. Особенно
губительна кислая среда для гнилостных бактерий, вызывающих
пищевые отравления. Более устойчивы бактерии, которые сами в
процессе жизнедеятельности образуют кислоты (уксуснокислые,
молочнокислые). Некоторые виды дрожжей, плесневых грибов
регулируют реакцию среды (подкисляют или подщелачивают).
Высушивание
К высушиванию чувствительны гонококки, менингококки,
трепонемы, лептоспиры. Высохшая мокрота больных туберкулезом
остается заразной 10 месяцев, споры бацилл сибирской язвы
сохраняются до 10 лет, плесневых грибов – 20 лет. Высушивание
сопровождается обезвоживанием цитоплазмы и денатурацией белков
микроорганизмов.
9.2. Действие химических факторов на микроорганизмы
По действию на микробы химические вещества можно
подразделить на поверхностно-активные вещества, красители,
фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители и
группу формальдегида. К поверхностно-активным веществам
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]