Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биохимия зерна и продуктов его переработки. Учебное пособие
.pdf
21
Сравнить декстринизующую способность амилаз солода и используемых в спиртовой промышленности ферментных препаратов
Глюкозим Л-400 и Термамил SE.
Задание 2. Определение осахаривающей способности β-амилазы
В мерную колбу на 100 см3 вносят 50 см3 2 % раствора растворимого крахмала и 5 см3 фосфатного буфера с рН-5,6. Содержимое
пробирки прогревают в водяной бане при 40 оС в течение 15 мин. Затем в колбу вносят 5 см3 ферментного препарата β-амилазы. Раствор в
колбе перемешивают и снова ставят в водяную баню при той же температуре на 30 мин. По истечении этого времени ферментативный
процесс гидролиза крахмала останавливают путем добавления 10 см3
раствора сернокислой меди ω(CuSO4) = 6 %. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры и доводят водой до метки. Количественное определение сахаров производят по методу Бертрана. Пересчет сахаров ведут на мальтозу, как на основной продукт распада
крахмала при действии β-амилазы. Мерой активности β-амилазы служит количество разложившегося крахмала, выраженное в процентах
от его первоначального веса.
Задание 3. Влияние температуры на активность β-амилазы
Температура оказывает большое влияние на скорость ферментативной реакции. При низких температурах (0-4 оС) ферментативные
реакции протекают с очень малой скоростью. Температура выше 60 оС
вызывает инактивацию большинства ферментов. Температурный оптимум многих ферментов лежит в пределах 40-50 оС.
Опыты ставят при значениях температуры 4 (холодильник), 20
(комнатная), 40 и 60 оС (водяная баня). Для получения хороших результатов необходимо строго выдерживать условия проведения анализа и в течение всего опыта поддерживать заданную температуру.
В мерную колбу на 100 см3 вносят 50 см3 2 % раствора крахмала
и 5 см3 фосфатного буфера с рН 5,6. Содержимое колбы доводят до
заданной температуры (нагревают или охлаждают), после чего вносят
5 см3 ферментного препарата, предварительно термостатированного
при той же температуре и замечают время. Гидролиз продолжается
30 мин, в течение которых строго следят за поддержанием постоянной
температуры. Через 30 мин в колбу вносят 10 см3 раствора сернокислой меди ω(CuSO4) = 6 % для прекращения действия фермента, содержимое колбы охлаждают и доводят водой до метки. Количество обра-
22
зовавшейся мальтозы определяют методом Бертрана. Полученные результаты сводят в таблицу и строят график, характеризующий влияние
температуры на активность β-амилазы.
Задание 4. Влияние рН на осахаривающую способность солодо-
вых амилаз
Каждый фермент проявляет свою активность в определенной зоне рН. Для определения влияния рН среды на осахаривающую способность солодовых амилаз проводится коллективная работа. Опыты ставят при постоянной температуре, но разных значениях рН (2,6; 4,4;
5,0; 5,8; 7,0; 8,0 и др.).
В мерную колбу на 100 см3 вносят 50 см3 2 % раствора крахмала
и 5 см3 соответствующей буферной смеси. Содержимое колбы прогревают в термостате или водяной бане до 40 оС, после чего вносят 5 см3
фермента, предварительно термостатированного при той же температуре. Продолжительность гидролиза 30 мин. Реакцию прекращают добавлением 10 см3 6 % раствора сернокислой меди, после этого колбу охлаждают, и объем смеси доводят водой до метки. Образовавшуюся под
действием амилаз мальтозу определяют методом Бертрана.
Полученные результаты сводят в таблицу и строят график, характеризующий влияние реакции среды на активность ферментов.
Задание 5. Влияние рН на декстринирующую способность солодовых амилаз
Для выяснения влияния рН на декстринирующую способность
амилаз берут 10 пробирок и наливают в каждую по 2,5 см3 буферных
растворов, состоящих из следующих количеств 0,2 М раствора
Na2HPO4 и 0,1 М лимонной кислоты.
Затем в каждую пробирку приливают по 5 см3 2 %-го раствора
крахмала и по 2,5 см3 экстракта солода (экстракт следует приливать,
начиная с 1-ой пробирки, через равные промежутки времени – 30 с).
Содержимое пробирок после добавления экстракта тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. По истечении этого времени берут
через каждую минуту пробу (2-3 капли) из седьмой пробирки и добавляют две капли йода. Спустя 2 мин после того, когда содержимое этой
пробирки будет давать красно-бурое окрашивание, во все пробирки
добавляют по несколько капель йода и взбалтывают. Раствор йода
следует приливать, начиная с первой пробирки, через равные промежутки времени, т.е. через 30 с.
23
Таблица 2 – Схема эксперимента
№ пробир-
ки
Количество, см3
рН буферной
смеси
0,2 М раствора
Na2 HPO4
0,1 М раствор ли-
монной кислоты
1
0,27
2,23
2,6 2 1,1
1,4
4,4 3 1,29
1,21
5,0 4 1,39
1,11
5,4 5 1,51
0,99
5,8 6 1,65
0,85
6,2 7 1,82
0,68
6,6 8 2,06
0,44
7,0 9 2,27
0,23
7,4
10
2,43
0,07
8,0
На основании полученной окраски содержимого пробирок можно судить о степени расщепления крахмала в зависимости от рН. Там,
где получилась слабо-желтая окраска, крахмал расщепился полностью,
и, следовательно, рН был оптимальным.
Контрольные вопросы
1. Что представляют собой ферменты?
2. В чем заключается каталитическая функция ферментов?
3. Что понимают под энергией активации?
4. Объясните механизм ферментативного катализа.
5. Каково строение ферменты?
6. Чем отличаются ферменты от неорганических катализаторов?
7. От каких факторов зависит активность ферментов?
8. Что такое активаторы ферментов? Какие вы знаете виды активаторов?
9. Что такое ингибиторы? Их классификация.
10. Что Вы понимаете под специфичностью действия ферментов? Ка-
кие вы знаете виды специфичности?
11. На какие классы и по какому принципу подразделяют ферменты?
12. Какие Вы знаете ферменты, входящие в состав зерна и продуктов
его переработки: а) I класса; б) II класса; в) III класса? Охарактеризуйте их.
24
3. БЕЛКИ
Белки играют исключительно важную роль в жизнедеятельности
любого живого организма. Основная масса протоплазмы живых клеток состоит из белков. Белки являются материальной основой жизни и
участвуют во всех важнейших процессах, протекающих в живом организме.
Около 25-30 % всей потребности организма в белках покрывается за счёт продуктов переработка зерна. В семенах злаков содержится
10-20 % белка, в семенах бобовых и масличных культур 25-50 %.
Именно белковые вещества определяют технологические свойства муки, ее способность давать высококачественный хлеб и макаронные изделия, а также определяют ценность различных круп.
Белковые вещества представляют собой высокомолекулярные
биополимеры, первичная структура которых образована полипептидными цепочками, построенными из различных α-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Молекулярный вес белков
может достигать нескольких миллионов.
В настоящее время известно около 220 аминокислот, однако
только лишь 22 α-аминокислоты могут входить в состав белков.
Общая формула α-аминокислот следующая:
NH2― CH―COOH
|
R
Благодаря присутствию аминной и карбоксильной групп, аминокислоты проявляют амфотерные свойства. В водных растворах они
диссоциируют как кислота и как основание.
Порядок включения аминокислот в состав белка определяется
генетическим кодом. В зависимости от характера боковых цепей (R)
аминокислоты делят на алифатические и циклические.
По числу аминных и карбоксильных групп различают аминокислоты: моноаминомонокарбоновые (глицин, аланин, валин, лейцин,
изолейцин, серии, тренин, цистеин, метионин, триптофан, тирозин,
фенилаланин); диаминомонокарбоновые (лизин, аргинин); моноаминодикарбоновые (аспарагиновая и глютаминовая кислоты); диаминодикарбоновые (цистин). Аминокислоты группируют по заряженности
боковых радикалов, их полярности: неполярные гидрофобные (гли-
25
цин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин); полярные, но незаряженные (серии, треонин, аспарагин, глутамин); полярные с отрицательным (аспарагиновая и глютаминовая кислоты, цистеин, тирозин) или положительным (лизин, аргинин, гистидин) зарядом.
По способности синтезироваться в организме человека аминокислоты делят на две группы: синтезируемые организмом человека и
животных, или заменимые, и несинтезируемые, или незаменимые (их
также называют обязательными).
Строение белковой молекулы
Различают четыре уровня структуры или организации белковой
молекулы: первичная, вторичная, третичная, четвертичная.
Первичная (линейная) структура белковой молекулы ‒ это последовательность, в которой отдельные аминокислоты соединяются в
полипептидной цепочке. Полипептидная теория строения белковой
молекулы, предложенная Эмилем Фишером, оказалась основополагающей, вокруг которой развиваются современные представления о
структуре белка. Первичной структурой белка называют последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной
цепи.
Вторичная (спиралевидная) структура белковой молекулы образуется благодаря водородным связям, возникающим между отдельными частями длинной полипептидной цепи. Она образуется за счет замыкания водородных связей между пептидными группами. Вторичная
структура представлена в основном регулярными структурами: αспираль, складчатые слои (β-структура), β-изгиб. Часть полипептидной цепи не имеет упорядоченного строения, такие участки называют
аморфными или бесструктурными областями.
В общем виде вторичную структуру можно охарактеризовать
так: в α-спиральных участках и участках с β-складчатой структурой
все последовательно расположенные пептидные звенья полипептидной цепи имеют идентичные взаимные ориентации. Такой участок полипептидной цепи имеет линейную структуру, формируется из линейных групп. В α-структуре между отдельными участками всей длинной
полипептидной части возникают водородные связи. В результате полипептидная цепь закручивается. Один полный виток спирали включает 3,6-аминокислотных остатка, а «шаг» спирали, соответствующий
одному аминокислотному остатку имеет длину 0,15 нм.
26
Складчатые участки полипептидной цепи образуются за счет водородных связей между полипептидными цепями. Отличительная
особенность β-структуры в том, что полипептидные цепи в ней вытянуты, расположены параллельно, их пептидные группы (С═О и —NН)
лежат в одной плоскости и ориентированы так, что могут образовывать водородные связи с соответствующими группами соседних цепей.
Складчатые участки полипептидной цепи образуются за счет водородных связей между полипептидными цепями. Отличительная
особенность β-структуры в том, что полипептидные цепи в ней вытянуты, расположены параллельно, их пептидные группы (С═О и —NН)
лежат в одной плоскости и ориентированы так, что могут образовывать водородные связи с соответствующими группами соседних цепей.
Складчатые участки полипептидной цепи проявляют кооперативные
свойства, т. е. стремятся расположиться рядом в белковой молекуле, и
формируют параллельные и антипараллельные складчатые слои или
листы, которые укрепляются благодаря водородным связям между
складчатыми участками цепи.
Антипараллельная β-структура образуется в том случае, если
складчатая цепь делает поворот назад и идет в обратном направлении;
в месте поворота образуется β-изгиб, в который входят четыре последовательно расположенных аминокислотных остатка. Параллельная βструктура складывается участками из полипептидной цепи, направления которых совпадают. Антипараллельность цепей создает наиболее
благоприятные условия для возникновения водородных связей между
ними при участии пептидных групп. В случае параллельного расположения цепей в структуре складчатого β-слоя водородные связи между
цепями менее прочны. Боковые радикалы аминокислотных остатков
(точнее связи Сα—Сβ) приблизительно перпендикулярны плоскости βскладчатых слоев, причем боковые цепи аминокислот ориентированы
поочередно то по одну, то по другую сторону этой плоскости.
Третичной структурой называют способ упаковки спиралевидной полипептидной цепочки в пространстве. При образовании третичной структуры важную роль играют дисульфидные связи (—S—S—),
образующиеся при окислении сульфгидрильных групп остатков цистеина, а также водородные при взаимодействии простанственно сближенных гидроксилсодержащих групп боковой цепи полипептида.
Кроме того в стабилизации третичной структуры важная роль отводится электростатическому взаимодействию протонированных аминогрупп и ионизированных карбоксильных групп боковых цепей по-
27
липептида и гидрофобному – при сближении алифатических групп боковых цепей в пространстве.
По форме белковой молекулы, сложившейся на третьем уровне
организации, различают белки глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки – растворимые вещества с компактной структурой. По
форме они приближаются к шару. Фибриллярные – имеют нитевидную форму. Они обычно нерастворимы.
Четвертичную структуру представляет ассоциация нескольких
отдельных полипептидных цепей. Ее создают водородные связи, электростатическое взаимодействие, гидрофобные и другие виды связи.
Молекулы многих белков состоят из мономеров, образованных
отдельными поли пептидными цепями. Ассоциация нескольких мономеров, их взаимное пространственное расположение в единой сложной молекуле составляют четвертичную структуру белка. Четвертичную структуру создают водородные связи, электростатическое взаимодействие разноименно заряженных групп, ван-дер-ваальсово взаимодействие боковых радикалов аминокислот и др.
Во второй половине 20 века расширены наши знания о факторах,
кодирующих и стабилизирующих специфические особенности пространственной структуры белков имеющих огромную молекулярную
массу от 500 тыс. до нескольких миллионов. Сложный механизм взаимодействия этих факторов составляют понятие и метод, называемый
по-английски Folding (фолдинг), переводимый на русский язык «свер-
тывание».
Объединение частей и, прежде всего аминокислот, свертывание
их в единое белковое целое, регулируется многими физикохимическими процессами на каждом этапе пространственного формирования белка. Особый интерес и особую роль в этих действиях играют аминокислоты, их последовательность связывания и разнообразные формы пространственного структурирования, начиная с первых
моментов появления длиннейших углеродных цепей. Изменения в том
же направлении сопровождают все другие уровни синтеза белков. Вся
совокупность пространственных структурных построений за весь период образования каждого белка порождает его своеобразие и особые
свойства. На международном симпозиуме, посвященном структуре,
стабилизации и фолдингу, прошедшему в Российской Академии Наук
в 1998 г., показано, что своеобразие и особые свойства каждого белка
приводят к тому, что одни из них могут вызвать неожиданные болезни
28
человека, а другие способны стать средством выдающегося лечебного
эффекта.
Классификация белков
По степени сложности строения все белка делят на две большие
группы протеины и протеиды.
Протеинами, или простыми белками, называют белки, в состав
которых входят только остатки аминокислот. В состав протеидов
кроме остатков аминокислот входят группы небелковой природы –
простетические группы, например, липиды, углеводы, нуклеиновые
кислоты.
Протеины, в свою очередь, делят еще на четыре группы, основываясь на характере их растворимости: альбумины – растворимые в воде; глобулины – растворимые в водных растворах различных солей (в
растворе хлорида натрия); проламины – растворимые в растворе этанола; глютелины – растворимые в растворах щелочей.
Протеины – белки, дающие при гидролитическом расщеплении
только аминокислоты. Это запасные, скелетные (опорные) и ферментные белки. При изучении протеинов (растительных белков) используют метод извлечения их фракций по растворимости (альбумины, глобулины, проламины и глютелины), предложенный американским исследователем Осборном.
Альбумины растворяются в воде, их можно выделить из раствора в виде сгустка денатурированного белка при кипячении. Из водных
растворов альбумины осаждают также высаливанием при насыщении
солями (сульфатом аммония и др.). Альбуминный комплекс зерна в
основном состоит из ферментов.
Глобулины растворяются в водных растворах различных солей
(применяют обычно 5-10 % раствор NаСl). В чистой воде они нерастворимы. Для выделения глобулинов из солевого раствора применяют
диализ с помощью полупроницаемых мембран или разбавляют большим количеством воды. Глобулины составляют большую часть семян
бобовых культур.
Проламины — наиболее характерные белки для зерна большинства злаковых культур. Они растворяются в 60-80 % растворе этанола.
К проламинам относят глиадин из зерна пшеницы и ржи (составная
часть клейковины), гордеин – ячменя, зеин – кукурузы, авенин – овса.
Глютелины растворяются в растворах щелочей (0,1-0,2 %). Они
мало изучены, так как их трудно выделить в чистом виде. Наиболее
изучены глютелин зерна пшеницы (составная часть клейковины), ори-
29
зенин риса и глютелин кукурузы. Разделение протеинов по растворимости носит условный характер.
Современными методами установлена гетерогенность каждой из
названных белковых фракций. Каждая из них состоит из нескольких,
во многих случаях из многих десятков различных белков, имеющих
некоторые общие свойства.
Протеиды (сложные белки) – это вещества, состоящие из белка
и соединения небелковой природы – простетической группы. По химической природе такие соединения подразделяют на липопротеиды,
хромопротеиды, гликопротеиды и нуклеопротеиды.
Липопротеиды, кроме белка, содержат липиды. Липопротеиды в
большом количестве входят в состав пластид растительной клетки
(хлоропласты), содержатся в протоплазме, особенно в мембранах.
Хромопротеиды – разнообразная группа, в которую входит гемоглобин крови. В гемоглобине белок глобин связан со сложным азотистым
соединением, содержащим железо. Это соединение является простетической группой и называется гемом. Гликопротеиды играют важную
роль в построении протоплазмы. Они содержат различные углеводы.
Нуклеопротеиды имеют огромное значение в наследственности.
Высоко содержание нуклеопротеидов в зародыше зерна. В нуклеопротеидах белок связан с нуклеиновыми кислотами.
Азот входит в состав не только белковых веществ. В зерне присутствуют и небелковые соединения, содержащие азот. Эти фракции
называют небелковым азотом. В нормальном зерне пшеницы на долю
небелкового азота приходится до 10 % от общего его содержания. К
небелковым азотсодержащим веществам относят главным образом
свободные аминокислоты и амиды, подавляющая часть которых сосредоточена в алейроновом слое и зародыше. Общее количество небелкового азота зависит от жизнедеятельности растения и зерна и может изменяться в ту или другую сторону. Повышенное содержание
небелкового азота в основном можно рассматривать как результат незавершенности биосинтеза белков в зерне или его порчи – распада
белковых веществ при неблагоприятных условиях его хранения и переработки (прорастание и др.).
Запасные белки – это аибольшая часть белков зерна злаковых и
бобовых (до 80 %), накопленных в ходе роста и развития зерна как питательные вещества, необходимых для развивающегося зародыша на
начальных этапах прорастания.
30
Запасные белки (проламины и глютелины) локализованы в эндосперме. Считалось, что эти белки не обладают ферментативной активностью. Однако в последнее время показано, что пшеничная клейковина, состоящая главным образом из проламина (глиадина) и глютелина (глютенина) проявляет ферментативную активность. Альбумины
и глобулины представлены в основном ферментами и структурными
веществами. Они входят в состав мембран субклеточных органелл
зерна, образуют белки рибосом, митохондрий, эндоплазматического
ретикулума – клеточной органеллы, представляющей собой систему
мелких вакуолей, соединенных между собой одинарной мембраной, в
ряде случаев переходящей в наружную ядерную мембрану.
В сложных белках – нуклеопротеидах, липопротеидах, фосфопротеидах и других белковую часть составляют альбумины и глобулины.
У бобовых культур запасные белки представлены главным образом солерастворимой фракцией (глобулинами), а у злаковых спирторастворимой (проламинами) и щелочнорастворимой (глютелинами).
Для белков важно содержание незаменимых (обязательных)
аминокислот. Для человека их восемь: лизин, метионин, триптофан,
валин, изолейцин, лейцин, треонин, фенилаланин. Эти аминокислоты,
как и все другие, синтезируют микроорганизмы и зеленые растения,
но не могут синтезироваться в организме животного и человека. Незаменимые аминокислоты должны быть обязательно введены в организм
человека или животного с пищей. Если их будет в пище недостаточно,
то нормальное развитие и жизнедеятельность организма нарушаются.
Отдельные белки могут быть биологически неполноценными по
своему аминокислотному составу. Однако необходимо исследовать
аминокислотный состав не отдельных белков, а всего их комплекса,
содержащегося в пищевом продукте. Только при таком подходе могут
быть получены правильные данные об аминокислотном составе, а,
следовательно, и о пищевой и кормовой ценности продукта. Белки
злаковых культур неполноценны по ряду незаменимых аминокислот,
прежде всего по лизину, метионину, триптофану и треонину. Для питания большое значение имеет сбалансированность аминокислотного состава белков.
По содержанию в белке незаменимых аминокислот, определяемых химическими методами, вычисляют аминокислотный скор, которым характеризуют биологическую ценность белка. В продукте (зерне) определяют содержание каждой незаменимой аминокислоты. Найденное количество вычисляют в процентах к содержанию той же ами-
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]