Ферментные препараты в животноводстве. Учебно-методическое пособие
.pdfВторое различие заключается в том, что ферменты
обладают необыкновенно высокой специфичностью действия. Каждый фермент катализирует, как правило, одну единственную химическую реакцию. Один фермент – одна реакция. Тем не менее, по специфичности ферменты подразделяются на 2 вида: 1) ферменты с абсолютной специфичностью и 2) ферменты с относительной или групповой специфичностью.
Для ферментов с относительной специфичностью субстратом является группа атомов в молекуле или связь. Например, пепсин. Субстратом для него является пептидная группировка атомов или пептидная связь. Пепсин расщепляет, как известно, белки, т.е. те молекулы, в которых присутствует пептидная группировка.
Для ферментов с абсолютной специфичностью субстратом является сама молекула, вступающего в химическую реакцию вещества. Большинство ферментов обладают абсолютной специфичностью.
Третье, одно из наиболее важных различий между неорганическими катализаторами и ферментами связан с белковой природой последних. Ферменты проявляют свою активность только в условиях водных растворов и при физиологических значениях рН и температуры среды.
По строению ферменты могут быть простыми и сложными белками. Небелковую часть сложного фермента, которая легко может отделяться от апофермента
11
(белковая часть фермента) и которая, как правило, представлена сложными органическими соединениями, называют коферментом.
Рис. 1. Строение сложного белка-фермента.
Небелковая часть фермента может быть представлена и простыми веществами неорганической природы, чаще ионами металлов, которые оказываются прочно связанными с апоферментом. В этом случае её называют - кофермент.
Из большого числа ферментов можно выделить особый класс - регуляторные ферменты, которые могут воспринимать различные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменять свою каталитическую активность. Благодаря действию таких ферментов все ферментативные системы в клетке функционируют координированно, что является необходимым для поддержания жизнеспособности отдельных клеток и целых организмов.
Различают несколько групп регуляторных ферментов. Наибольшее значение из них имеет аллостерические ферменты, которые кроме активного центра содержат ещё второй центр, называемый аллостерическим. Алло-
12
стерический центр - это участок молекулы фермента служащий для присоединения определенного низкомолекулярного вещества – медиатора. Медиаторы бывают двух видов: активаторы и ингибиторы, которые вызывают изменение конфигурации активного центра и соответственно, либо увеличение, либо снижение каталитической активности фермента.
В настоящее время известно около 5000 различных ферментов. Согласно международной системе классификации и номенклатуры различают 6 классов ферментов. Каждый класс подразделяется на подклассы, а подклассы на группы.
1.Оксидоредуктазы - катализируют окислительно - восстановительные реакции.
2.Трансферазы - катализируют реакции переноса функциональных групп и остатков молекул.
3.Гидролазы - катализируют реакции гидролиза.
4.Лиазы - катализируют негидролитическое расщепление связей образованных с участием углерода.
5.Изомеразы - катализируют реакции изомеризации.
6.Лигазы (синтетазы) - катализируют реакции синтеза или образования новых связей.
По международной системе классификации оксидоредуктазы подразделяются на 23 подкласса, трансферазы – на 10, гидролазы – на 13 и т.д. В таблице 1 пред-
13
ставлены названия некоторых подклассов оксидоредук-
таз взятых с сайта NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)
Таблица 1. Оксидоредуктазы.
EC 1. Oxidoreductases
EC 1.1. Acting on the CH-OH group of donors
EC 1.2. Acting on the aldehyde or oxo group of do-
nors
EC 1.3. Acting on the CH-CH group of donors EC 1.4. Acting on the CH-NH2 group of donors EC 1.5. Acting on the CH-NH group of donors EC 1.6. Acting on NADH or NADPH
EC 1.7. Acting on other nitrogenous compounds as donors
EC 1.8. Acting on a sulfur group of donors EC 1.9. Acting on a heme group of donors
EC 1.10. Acting on diphenols and related substances as donors
EC 1.1 1. Acting on a peroxide as acceptor EC 1.1 2. Acting on hydrogen as donor
• Other oxidoreductases
Системные названия ферментов указывают на тип катализируемой реакции, на характер субстрата и продукта реакции. Очень часто эти названия бывают длинными и в связи с этим неудобными для использования.
14
Международная система классификации и номенклатуры ферментов предполагает присвоение каждому ферменту кодового номера (шифр) из четырехзначной цифры. Первая цифра кода указывает на класс, вторая – на подкласс, третья – на группу, а четвертая – порядковый номер фермента в группе.
Большинство ферментов содержащихся в ферментативных препаратах, выпускаемых в настоящее время и потребность в которых определяется десятками тысяч тонн, относятся к третьему классу - гидролазам. Кроме того, подавляющее количество препаратов являются комплексными, содержащими помимо основного фермента еще значительное количество сопутствующих ферментов и белков.
Существует специальная система номенклатуры ферментных препаратов, в которой учитываются основной фермент, источник и способ получения, степень очистки.
Наименование каждого препарата включает сокращенное название основного фермента, видовое название продуцента и заканчивается название препарата суффиксом «ин». Например, амилолитический препарат, получаемый из культуры Bacillussubtilis называется амилосубтилин (амило-субтил-ин). Далее ставится индекс, состоящий из букв «Г» и «П», а также из цифр от 2 до 20. В индексе обозначиваются способ производства и степень
15
очистки фермента от балластных веществ и форма выпуска препарата.
При глубинном спосбе культивирования после названия ставится буква Г, а при поверхностном – П. Если препарат является неочищенным продуктом культуры продуцента, то далее следует буква х. Между буквами П, Г и х может стоять цифры 2 и 3. Индекс 2 означает, что препарат представляет собой жидкий концентрат исходной культуры, 3 – сухой ферментный препарат, полученный высушиванием экстракта из поверхностной культуры или культуральной жидкости.
Если препарат очищенный, то после букв П и Г ставятся только цифровые индексы. Например, 10 – сухие препараты полученные осаждением ферментов органическими растворителями или методом высаливания. Индексы 15, 18, 20 обозначают препараты частично очищенные не только от балластных веществ, но и от сопутствующих ферментов. В номенклатуре ферментных препаратов индексы выше 20 не используются, так как в этих случаях речь идет о высокоочищенных и гомогенных препаратах.
Ферментные препараты, в зависимости от происхождения и предназначения подразделяются на ряд классов. По происхождению различают 2 основных класса:
1. Ферментные препараты микробного синтеза;
16
2. Ферментные препараты других групп (животного и растительного происхождения).
По предназначению можно выделить:
- ферментные препараты для использования в медицине; - ферментные препараты для пищевой и перераба-
тывающей промышленности;
- ферментные препараты для сельскохозяйственного предназначения и др.
Каждую из этих классов можно разделить еще на ряд групп. Например, существует клиническая классификация ферментных препаратов используемых в медицине:
1. Препараты, применяемые преимущественно при гнойно-некротических процессах (трипсин, химотрипсин, химопсин, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза и
др.);
2.Фибринолитические препараты (фибринолизин, стрептолиаза, стрептодеказа и др.);
3.Ферментные препараты, улучшающие процессы пищеварения (пепсин, сок желудочный натуральный, абомин, панкреатин, пепсидил и др.);
4.Разные ферментные препараты (лидаза, ронидаза, пенициллиназа и др.).
17
Ферментные препараты сельскохозяйственного предназначения можно классифицировать по следующей схеме:
1)используемые в растениеводстве:
-для борьбы с химизацией почвы;
-для улучшения качества кормов и др.
2)используемые в животноводстве:
-для ветеринарии (лечебно-профилактические);
-кормовые (кормовые добавки) и др.
Наиболее многочисленными и широко применяемыми в животноводстве являются кормовые ферментные препараты.
Определение активности ферментных препаратов
Ферменты являются веществами белковой природы. Поэтому определить их количественно в смеси с другими белками практически невозможно. Наличие того или иного фермента в данном препарате можно установить только по результатам той реакции, которую катализирует фермент. Результат реакции определяется по количеству образовавшихся продуктов или по количественному уменьшению исходного вещества (субстрата фермента).
Таким образом, в основе всякого количественного определения ферментативного действия или активности действия фермента находятся изменения, которые про-
18
исходят с субстратом соответствующей ферментативной реакции.
Наиболее часто активность действия ферментов выражается количеством вещества, которое за строго определенное время и в строго определенных условиях подвергалось тому или иному изменению. Ферментативное действие может быть оценено также временем, необходимым для строго определенного изменения субстрата.
Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: температура и рН среды, концентрация субстрата и фермента и др.
Поэтому согласно заключению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза были приняты правила определения активности ферментативных препаратов и выражения их в единицах активности.
На русском и немецком языках единица активности обозначается буквой Е, на английском – U.
Стандартная единица активности (Е) фермента – это количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин при стандартных условиях.
В ферментативных реакциях очень часто бывает так, что количество субстрата нельзя выразить числом микромолей из-за невозможности точного определения массы молекулы. Например, при действии гидролаз на
19
белок, крахмал и др., т.е. когда субстратом являются биологические полимеры.
Вэтих случаях определяют не количество субстрата
вмикромолях, а микроэквивалент участвующих в реакции функциональных групп молекулы. Так, при гидролизе белка определяют количество образовавшихся свободных карбоксильных или аминных групп, т.е. число расщепленных пептидных связей. При гидролизе полисахаридов – гликозидных связей и т.д.
Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендовала при установлении активности фермента придерживаться определенных условий. Так, например, вести все исследования при температуре 300С и по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента и соответствует кинетике реакции нулевого порядка. Концентрации фермента и субстрата, рН выбирают оптимальными для данного фермента.
Если количество используемого субстрата очень мало или слишком велико, допускается выражение результатов в миллиединицах (мЕ) и в килоединицах (кЕ).
Содержание фермента в данном препарате условно выражается в стандартных единицах активности фермента на 1 мл ферментного раствора, если препарат жидкий, или на 1 г препарата, в том случае, когда препарат сухой.
20