Биотехнология пищевых и кормовых продуктов. Учебное пособие

На предферментационной стадии осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды. Для приготовления среды исполь- зуется крахмал, который предварительно подвергается клейстериза- ции при 60 ºС и обработке в течение 20 мин ферментом – термоста- бильной α-амилазой (термоамил 120 L) – для частичного гидролиза и снижения вязкости.

Растворы питательных солей готовятся и стерилизуются от- дельно. Стерилизация проводится в автоклаве при избыточном давле- нии 0,05 МПа в течение 40 мин.

На стадии получения посевного материала инокулят предвари-

тельно выращивается в поверхностных условиях в чашках Петри на сусло-агаре или овсяном агаре. Поверхностная культура используется для дальнейшего выращивания и накопления биомассы в глубинной культуре в колбах на качалках. Далее исходный инокулят из колб передается в посевной биореактор-инокулятор первой стадии, где выращивание ведется при непрерывном перемешивании и аэрации в течение 72 ч при температуре 26–28 ºС. Концентрация биомассы посевного мицелия на этапе приготовления инокулята 1–2 г/л. Накоп- ление биомассы ведут до 10–12 г/л биомассы мицелия.

Выращенный инокулят по стерильному трубопроводу самоте- ком последовательно поступает в посевной биореактор-инокулятор второй стадии объемом 100 л.

Затем выращенная до концентрации биомассы 10–12 г/л культу- ра поступает в большой посевной биореактор третьей стадии накоп- ления посевного материала объемом 1 м3.

Из посевного биореактора культуральная жидкость (КЖ) пере- качивается по стерильному трубопроводу в биореакторы основного производства объемом 10 м3.

Стадия основного производства. Первый вариант технологиче-

ского процесса предусматривает периодическое культивирование отъемно-доливным методом в реакторах объемом 10 м3 с коэффици- ентом заполнения 0,5. В данном случае при достижении концентра- ции биомассы 14 г/л (в расчете на абсолютно сухое вещество) часть культуральной жидкости из биореактора сливается и передается на переработку. Биореактор заполняется питательной средой до конеч-

30 ч с учетом времени на слив КЖ и заполнение биореактора свежей питательной средой. Урожай абсолютно сухой биомассы за один цикл

82

культивирования составит около 45 кг, или товарной продукции влажностью ~ 10 % около 50 кг.

Второй вариант технологического процесса предусматривает непрерывное культивирование также в реакторах объемом 10 м3 при скорости разбавления 0,04 ч–1 и производительности по биомассе 0,39 г/ л·ч. Далее КЖ с выращенной биомассой из биореакторов пода- ется на пресс-фильтр, где биомасса отделяется от отработанной куль- туральной жидкости. Влажная биомасса подается в аппарат для суш- ки во взвешенном слое и далее на упаковку. Отработанная культу- ральная жидкость передается либо на биологическую очистку, либо на вторую стадию культивирования для получения посевного мате- риала и последующего засева в блоки растительного субстрата с це- лью получения кормовых продуктов, обогащенных белком.

Сухой продукт имеет вид светло-бежевого порошка с грибным запахом, содержит не менее 40 % белка, витамины, липиды, мине- ральные вещества и может быть использован в пищу как белковая до- бавка, источник незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот, а также пищевых волокон.

3.5. Ассоциативное культивирование микроорганизмов как способ повышения эффективности производства грибного протеина

из растительного сырья

Сущность совместного культивирования микроорганизмов на субстратах, содержащих крахмал и целлюлозу, состоит в том, что один из микроорганизмов в процессе роста синтезирует гидролитиче- ские ферменты, превращающие полисахариды субстрата в моносаха- риды, потребляемые вторым микроорганизмом. Дрожжи и бактерии в качестве симбионтов наряду с сахарами способны использовать ме- таболиты грибов, например органические кислоты и спирты. Конеч- ный продукт представляет собой смесь биомассы микроорганизмов с неутилизированным субстратом.

Известна технология получения белка на питательной среде из картофеля (без предварительного гидролиза крахмала), в которой применяется смешанная культура дрожжей Endomycopsis и Torula.

Изучение образования целлюлазы и кормового белка грибом Trichoderma viride на среде с обработанной щелочью ячменной соло- мой в качестве источника углерода показало, что дополнительная

83

инокуляция дрожжами Saccharomyces cerevisiae или Candida utilis со-

кращает срок максимального образования фермента и белка, а полу- ченный продукт почти не отличается по аминокислотному составу от белка Т. viride. Предложено после окончания роста дрожжей культу- ральную жидкость засевать бактериями, например азотобактером, синтезирующими витамины и незаменимые аминокислоты.

При получении бактериально-грибной биомассы на депротеини- зированной молочной сыворотке предварительно выращивают Escherichia coli, затем Рenicillium roqueforti, Zygorrhynchus melleri, Oospora lactis, Rhizopus oligosporus. Выращивание E. coli обогащает биомассу серосодержащими аминокислотами. Биологическая ценность полу- ченной биомассы, выраженная в единицах NPU (коэффициент утили- зации чистого белка), составляет 37,8–44,5, что выше NPU для Torula utilis (27,0) и Bacillus megatherium (34,5).

Перспективность применения смешанных популяций микроор- ганизмов основана на принципе «кооперативного метаболизма», который сводится к более полному использованию углеродного субстрата. Известен способ получения дрожжевой биомассы путем выращивания ассоциативной культуры Candida humicola 6 и С. tropicalis 8 на питательной среде из картофельного сока. Однако из-за низкой концентрации сахаров получаемое количество биомассы сравнительно невысокое.

С целью повышения интенсивности образования биомассы, бо- лее полного использования компонентов питательной среды и улуч- шения белкового состава изучена возможность совместного выращи-

вания гриба Penicillium digitatum 24П с дрожжами Candida Кр-9 и С. utilis и бактерией Acinetobacter calcoaceticus 30–10.

Образование белка смешанной культурой Penicillium digitatum 24П и дрожжей. Возможность получения белковой биомассы путем глубинного культивирования кормовых дрожжей Candida tropicalis СК-4 на предварительно гидролизованном отходе переработки карто- феля на крахмал – мезге и клеточном соке доказана ранее, в 1970-х годах. За четыре часа роста в плотной популяции прирост влажных дрожжей (25 % от сухого веса) достигает 28,88 г/л, или 7,22 г/л в пе- ресчете на абсолютно сухие дрожжи, а содержание сырого протеина в них достигает 51 % массы абсолютно сухого вещества.

Микроскопический гриб Penicillium digitatum 24П на негидроли- зованной мезге и клеточном соке картофеля при культивировании в колбах на качалке накапливает за 48–72 ч до 15–20 г/л сухой биомас- сы с содержанием сырого протеина 50–60 %.

84

Совместное культивирование гриба и дрожжей осуществляли двумя способами: в первом случае гриб засевали одновременно с дрожжами, во втором – дрожжи засевали с интервалом в 1, 2 и 3 суток после выращивания культуры гриба. С целью контроля параллельно выращивали монокультуры гриба и дрожжей. Культивирование про- водили в колбах Эрленмейера на качалке (200 об/мин). Критериями оценки результатов служили концентрация биомассы, содержание сырого протеина и биологическая ценность белка.

Культуру дрожжей поддерживали на сусло-агаре. Для получе- ния инокулюма жидкие среды с суслом засевали смывом с 7-суточ- ного скошенного агара и выращивали при температуре 30 °С в тече- ние 2–3 сут. Инокулят в количестве 4 об. % вносили в питательную среду, которая содержала 2 % массы сухого вещества крахмала кар-

тофеля и соли: NH4NO3 – 4,5 г/л, KH2PO4 – 4,0 г/л, MgSO4 – 0,5 г/л;

начальный рН среды 5,5–5,8.

Одновременный засев среды грибом и дрожжами не дает же- лаемых результатов: в получаемой биомассе остается большое коли- чество неутилизированного субстрата. Аналогичная картина наблю- дается при использовании монокультуры дрожжей. Не синтезируя гидролитических ферментов, дрожжи не способны расщеплять ком- поненты субстрата и обеспечивать себя легкоусвояемыми сахарами.

При засеве питательной среды двухсуточным вегетативным ми- целием гриб быстро развивается, и засев дрожжей можно проводить уже через 24–36 часов с начала культивирования.

Биомасса монокультур по своему составу имеет существенные различия: максимум истинного белка – 51,6 % – отмечен у гриба Penicillium digitatum, большее количество жира – у дрожжей рода Candida. Низкое содержание хитина в клеточных стенках С. utilis – 0,52 % – соответствует минимальной переваримости сырого протеина in vitro – 75,9 %, в то время как при со держании хитина 1,91 (С. sp. Кр-9) и 3,77 % (Р. digitatum 24П) переваримость сырого протеина со- ставляет 83,3 и 89,7 % соответственно. Этот факт подтверждает дан- ные о том, что хитин не оказывает влияния на переваримость протеи- на микробной биомассы.

Общее содержание нуклеиновых кислот в биомассе гриба менее 1 %, в биомассе дрожжей – примерно 2,5–2,8 %. Безазотистых экс- трактивных веществ (БЭВ) в биомассе дрожжей в 3–4 раза больше, чем в биомассе гриба. При откорме взрослых животных безазотистые экстрактивные вещества легко трансформируются в жир.

85

Совместное выращивание гриба и дрожжей способствует повы- шению концентрации биомассы. Лучшие результаты получены при использовании в качестве симбионта дрожжей Candida sp. Кр-9. По сравнению с культурой гриба содержание истинного белка уменьша- ется, а по сравнению с монокультурой дрожжей возрастает. Смешан- ная биомасса имеет более высокую переваримость сырого протеина, содержание хитина в ней (3,6–3,7 %) превосходит концентрацию его в дрожжах, достигая соответствующей величины в биомассе гриба.

Отмечено увеличение концентрации нуклеиновых кислот до 1,73–1,79 % (концентрация их в монокультуре гриба 0,57 %), что, од- нако, меньше содержания нуклеиновых кислот в самих дрожжах (2,5–2,79 %). Высокая концентрация нуклеиновых кислот в биомассе дрожжей и бактерий является одной из причин, препятствующих их применению в питании человека, поэтому симбиотическое культиви- рование дрожжей с грибами можно рассматривать как один из спосо- бов уменьшения концентрации нуклеиновых кислот в биомассе.

В процессе совместного выращивания происходят существен- ные изменения в содержании сахаров и БЭВ.

Концентрация общих сахаров в биомассе монокультур дрожжей составляет 15,3 и 21,7 %, а в биомассе гриба – 8,96 %; соответственно концентрация БЭВ дрожжей – 44,46 и 38,23 %, гриба – 13,59 %.

Вбиомассе смешанных культур количество сахаров снижается до 9,1–9,2 %, а БЭВ – до 13,08–15,44 %, т. е. практически до того же ко- личества, что и в биомассе монокультуры гриба (13,59 %). Известно, что в организме животных БЭВ могут сберегать и экономить белок.

Вкорнеплодах и зерне на долю БЭВ приходится до 70–80 % массы всего сухого вещества, в зеленом корме, сене, соломе – до 40–50 %. Снижение БЭВ уменьшает общую кормовую ценность биомассы.

Сравнительное изучение аминокислотного состава белка био- массы моно- и смешанной культуры показывает снижение в смешан- ной культуре количества многих аминокислот, что связано, вероятно, с более низким содержанием их в белке дрожжей. Исключение со- ставляют аминокислоты серин, глицин, цистин, изолейцин и фенил- аланин, количество которых в расчете на сырой протеин увеличивает-

ся соответственно с 5,5 до 6,4; с 3,1 до 3,6; с 0,25 до 0,34; с 2,8 до 2,9 и с 3,4 до 3,6 %.

Уменьшение содержания аминокислот в белке ассоциативной культуры снижает индекс Осера до 52,5 против 65,5 в белке моно- культуры гриба. Это значение, однако, близко к показателю для муки

(60,3) и зерна (70,1).

86

Как видно, совместное выращивание микроскопического гриба

идрожжей по сравнению с монокультурой гриба увеличивает кон- центрацию биомассы на 18–35 %, повышает содержание истинного белка на 38,9-61,3 % (14,9–17,3 г/л культуральной жидкости против 10,73 г/л), но ухудшает качество белка: уменьшает индекс Осера (52,5 против 65,5) и снижает биологическую ценность белка на 22,5 %.

Образование белка смешанной культурой Penicillium digitatum 24П и бактерий. С целью увеличения выхода биомассы, истинного белка и повышения его биологической ценности микроскопический гриб Penicillium digitatum 24П выращивали совместно с бактерией

Acinetobacter calcoaceticus 30-10, полученной в Институте микро-

биологии Белоруссии.

Питательную среду (депротеинизированный сок картофеля, со- держащий 3 % сухих веществ, без добавочных солей и ростовых фак- торов) стерилизовали при 0,075 МПа, доводили pH до 5,0–5,8, засева- ли 4 % гриба и выращивали его в течение 20-24 ч. Затем в среду с растущим грибом вносили 3–5 % 1-суточного инокулюма бактерии, выращенной на клеточном соке картофеля при pH 7,0–8,0 и темпера-

туре 24–26 °С.

Совместное культивирование осуществляли в колбах на качалке (200 об/мин) в течение 48–60 ч, в ферментаторе при скорости пере- мешивания среды мешалкой 200 об/мин, норме аэрации 0,5–1,0 л воз- духа на 1 л жидкой среды в 1 мин и продолжительности процесса 30–36 ч. Выращивание в ферментаторе значительно сокращало время культивирования. Биомассу отделяли фильтрованием и высушивали.

На картофельном соке, содержащем 3 % сухих веществ, Penicillium digitaium 24П накапливает 10–15 г/л биомассы в расчете на сухую с содержанием сырого протеина в ней 60–65 % и истинного белка

40–50 %. Выращивание бактерии Acinetobacter calcoaceticus 30-10 на том же субстрате неэффективно, так как, несмотря на высокое содер- жание сырого протеина и истинного белка, концентрация биомассы не превышает 5–7 г/л. При совместном выращивании гриба с бактерией без удлинения времени культивирования концентрация биомассы дос- тигает 16–18 г/л, а содержание сырого протеина и истинного белка по- вышается и составляет соответственно 70–80 и 65–70 %.

Анализ данных культивирования указывает на преимущество ассоциативного культивирования гриба с бактерией. Сумма амино- кислот (истинный белок) увеличивается с 40–50 % в биомассе гриба

и53–60 % в биомассе бактерии до 65–70 % в смешанной культуре. Установлено, что в белке ассоциативной культуры среднее содержа-

87

ние метионина возрастает на 19 %, лизина – на 14; серина – на 67,7; треонина – на 46,3; валина – на 66; лейцина – на 52,3 %.

Таким образом, совместное выращивание микроскопического гриба и бактерии на картофельном соке без добавочных минеральных солей и факторов роста по сравнению с монокультурой гриба увели- чивает концентрацию биомассы на 20–60 %, повышает содержание истинного белка на 86,6–134 % (11,2–11,7 г/л культуральной жидко- сти против 5–6 г/л), одновременно улучшает качество белка, увеличи- вая индекс Осера до 75–85 (против 62–67) и повышая биологическую ценность белка на 27,5 %.

Получение смешанной биомассы гриба и бактерии одновремен- но способствует более полному использованию компонентов пита- тельной среды, что приводит к снижению концентрации остаточных биогенных веществ посткультуральной жидкости, уменьшает ее БПК и делает технологию производства микробного протеина более безопасной с точки зрения экологии.

Контрольные вопросы и задания

1.Охарактеризуйте основные стадии технологии получения белковых препаратов на метаноле.

2.Охарактеризуйте основные стадии технологии получения белковых препаратов на этаноле.

3.Опишите основные стадии технологии получения белковой биомассы на водороде.

4.Какие задачи решает создание малотоннажных производств микробного белка? Как решаются вопросы охраны окружающей среды?

5.Как рассчитать баланс переработки макроэлементов органи- ческого субстрата в биомассу микроорганизмов?

6.Какова кинетика процесса переработки макроэлементов ор- ганического субстрата в биомассу микроорганизмов?

7.Как определяется производительность ферментатора по ос- новным лимитирующим факторам?

8.Охарактеризуйте базидиомицеты как продуценты белка в ус- ловиях глубинного культивирования.

9.В чем состоят технологические особенности выращивания глубинного мицелия базидиомицетов?

10.В чем заключаются достоинства ассоциативного культиви- рования микроорганизмов для получения белковых продуктов?

88

ПОСЛЕСЛОВИЕ

Несмотря на усилия, прилагаемые учеными, на сегодняшний день вопрос дефицита белковых пищевых и кормовых продуктов ос- тается нерешенным. Во многих странах мира актуальна проблема «белкового голодания». Известно, что дефицит белка в питании явля- ется одним из главных факторов низкой продолжительности жизни.

В учебном пособии «Биотехнология белковых пищевых и кор- мовых продуктов» представлены как прошедшие успешную апроба- цию в условиях современного производства, так и инновационные разработки последних лет в области биотехнологии микробных белков.

Рассмотрены вопросы использования различных групп микро- организмов в качестве биотехнологических агентов – продуцентов белков; изложены принципы проектирования и создания производств по переработке различных органических субстратов в белковую био- массу и анализа показателей технологического процесса на соответ- ствие исходным научным разработкам. Показана перспективность решения проблемы острого дефицита белка в современном мире методами промышленной биотехнологии.

Материал учебного пособия сформирован таким образом, чтобы продемонстрировать обучающимся, что сегодняшнее развитие био- технологии связано с переходом к новым прогрессивным технологи- ям, основанным на последних достижениях в таких областях науки, как генная инженерия, селекция, молекулярная и клеточная биология, прикладная биохимия и микробиология, а также на современных экологически чистых и ресурсосберегающих производственных принципах и подходах.

89

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Биологические особенности лекарственных макромицетов в культуре : сб. науч. тр. В 2 т. Т. 1 / под ред. С. П. Вассера. – Киев : Альтерпрес, 2011. – 212 с.

2.Биореакторы : учеб. пособие / С. М. Воронин [и др.] ; Сиб. гос. технол. ун-т. – Красноярск, 2000. – 76 с.

3.Биотехнология : учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 1: Проблемы и перспективы / Н. С. Егоров, А. В. Олескин, В. Д. Самуилов. – М. : Высш. шк., 1987. – 159 с.

4.Бирюков, В. В. Основы промышленной биотехнологии : учеб. пособие / В. В. Бирюков. – М. : Колос, 2004. – 295 с.

5.Варфоломеев, С. Д. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов : учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов / С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. – М. : Высш. шк., 1990. – 296 с.

6.Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во Сиб. отд-ния Рос. акад. наук, 1999. – 252 с.

7.Волова, Т. Г. Микробиологический синтез на водороде / Т. Г. Волова, И. А. Терсков, Ф. Я. Сидько. – Новосибирск : Наука. Сиб. отд-ние, 1985.

8.Гапонов, К. П. Процессы и аппараты микробиологических производств / К. П. Гапонов. – М. : Легкая и пищ. пром-сть, 1981. – 240 с.

9.Кафаров, В. В. Моделирование биохимических реакторов / В. В. Кафаров, А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев. – М. : Лесн. пром-сть, 1979. – 344 с.

10.Кафаров, В. В. Моделирование и системный анализ биохи- мических производств / В. В. Кафаров, А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев. –

М. : Лесн. пром-сть, 1985. – 280 с.

11.Миронов, П. В. Основы кинетики ферментативных и микро- биологических процессов / П. В. Миронов, Е. В. Алаудинова ; Сиб. гос. технол. ун-т. – Красноярск, 2013. – 130 с.

12.Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов

иклеток / С. Дж. Перт. – М. : Мир, 1978. – 332 с.

13.Пленочные биореакторы / Н. А. Войнов [и др.]. – Красноярск :

БОРГЕС, 2001. – 252 с.

14.Промышленная микробиология / З. А. Аркадьева [и др.]. – М. :

Высш. шк., 1989. – 688 с.

90