Билеты к экзамену

Вопрос 13 «Терминация транскрипции»

Вопрос 14 «Примеры контроля активности транскрипционных факторов на уровне транскрипции, процессинга, времени полужизни, трансляции мРНК, действующего транскрипционного фактора»

Контроль экспрессии генов в клетке редко сводится к простому принципу «есть транскрипционный фактор — значит ген включён». В действительности клетка располагает многоуровневой системой регуляции, которая позволяет точно дозировать экспрессию во времени, пространстве и по интенсивности. Особенно важно, что регуляция может быть реализована не только на уровне синтеза РНК (транскрипции), но и на последующих стадиях: обработке (процессинге) транскрипта, определении его стабильности и времени полужизни, эффективности трансляции, а также на уровне активности уже синтезированного транскрипционного фактора. Такой многоступенчатый контроль делает регуляцию одновременно гибкой и надёжной: клетка может запускать быстрые ответы без ожидания синтеза новых белков, может «гасить» сигнал на любом этапе, а также может комбинировать регуляторные входы для создания сложной логики экспрессии.

Регуляция на уровне транскрипции: управление скоростью инициации и сборкой транскрипционного комплекса

Регуляция на уровне транскрипции означает изменение вероятности и/или скорости инициации транскрипции конкретного гена. В эукариотах она обычно реализуется через связывание транскрипционных факторов с энхансерами и промоторными элементами, привлечение коактиваторов или корепрессоров, модификацию хроматина и изменение эффективности сборки базальной машины Pol II. В прокариотах аналогичный контроль реализуется через доступность промотора для РНК-полимеразы и взаимодействие с активаторами/репрессорами в области оператора.

Хороший пример транскрипционного контроля — факторы семейства SOX. Эти белки содержат HMG-домен и часто действуют как регуляторы программ развития и дифференцировки. Их роль не ограничивается «включением» промотора: SOX-белки нередко выполняют архитектурную функцию, изменяя локальную геометрию ДНК и создавая условия для кооперативной посадки других факторов. В результате транскрипция целевых генов становится возможной только в тех клетках и в те моменты, где одновременно присутствует нужный набор партнёров (например, POU-факторы), коактиваторы и «открытое» состояние хроматина. Таким образом, контроль SOX на уровне транскрипции — это пример комбинаторной логики: сам фактор может присутствовать, но без правильного контекста активной транскрипции не будет.

Другой типичный пример — метаболически и стресс-зависимая регуляция транскрипции через специфические промоторные элементы и активируемые сигнальными путями транскрипционные факторы. В таких случаях клетка меняет экспрессию набора генов, переключаясь между программами роста, ответа на

повреждение, адаптации к дефициту субстратов. В рамках учебной логики важно подчеркнуть: транскрипционный контроль позволяет «экономить» ресурсы, поскольку предотвращает синтез ненужных транскриптов и белков, но он не всегда самый быстрый — поэтому клетка дополняет его посттранскрипционными механизмами.

Регуляция на уровне процессинга: сплайсинг и формирование «вариантов смысла» из одного транскрипта

Даже если транскрипция уже запущена, экспрессию можно радикально изменить на стадии процессинга. Главный механизм здесь — альтернативный сплайсинг, при котором из одного и того же пре-мРНК образуются разные зрелые мРНК, кодирующие различные белковые изоформы. Это принципиально важный уровень регуляции для многоклеточных организмов, так как он многократно увеличивает разнообразие протеома без увеличения числа генов.

Процессинговый контроль может менять не только аминокислотную последовательность белка, но и наличие/отсутствие ключевых доменов: домена ДНК-связывания, домена димеризации, сигналов ядерной локализации, мотивов взаимодействия с коактиваторами. В результате одна изоформа может быть активным транскрипционным фактором, а другая — доминант-негативным ингибитором, который связывает партнёра, но не активирует транскрипцию. С точки зрения регуляции это чрезвычайно выгодно: клетка может быстро переключать функциональный результат экспрессии гена, изменяя работу сплайсосомы и сплайсинг-факторов, не затрагивая саму транскрипцию.

К процессинговому контролю следует отнести и альтернативное использование сайтов полиаденилирования, меняющее длину 3’-UTR. Хотя это формально относят к 3’-процессингу, функционально эффект часто проявляется как «сплайсинг по смыслу»: укороченная или удлинённая 3’-UTR изменяет число сайтов для микроРНК и РНК-связывающих белков, тем самым меняя стабильность и трансляцию транскрипта.

Регуляция времени полужизни мРНК: стабильность как «усилитель» или «глушитель» сигнала

Время полужизни мРНК определяет, как долго транскрипт будет доступен для трансляции. Два гена могут транскрибироваться с одинаковой скоростью, но давать совершенно разные уровни белка, если одна мРНК живёт часы, а другая — минуты. Поэтому контроль стабильности — это мощный способ тонко настраивать экспрессию, особенно в быстрых ответах на стресс или сигнал.

Классические механизмы регуляции стабильности включают наличие cisэлементов в 3’-UTR (например, AU-богатых участков), которые распознаются РНК-связывающими белками. Эти белки могут либо защищать мРНК от деградации, либо, наоборот, рекрутировать комплексы deadenylation и decapping, ускоряя разрушение транскрипта. МикроРНК образуют ещё один важнейший

слой: они направляют комплексы подавления экспрессии к комплементарным участкам 3’-UTR, вызывая деградацию мРНК или торможение трансляции. Функционально контроль стабильности особенно важен, когда клетке нужно быстро убрать транскрипт после завершения ответа. Например, мРНК факторов воспаления, стресс-ответа и некоторых регуляторов клеточного цикла часто имеют короткий период полужизни, чтобы сигнал не «перетекал» во времени и не становился хроническим.

Регуляция на уровне трансляции: управление синтезом белка без изменения уровня мРНК

Трансляционный контроль позволяет клетке быстро менять синтез белка даже при неизменном количестве мРНК. Это особенно важно в стрессовых условиях, когда общая трансляция может подавляться, но синтез избранных белков, напротив, должен усиливаться. Одним из наиболее наглядных учебных примеров является регуляция трансляции транскрипционного фактора GCN4 у дрожжей.

МРНК GCN4 содержит в 5’-нетранслируемой области несколько коротких upstream ORF (uORF). В нормальных условиях рибосома инициирует трансляцию на uORF и после завершения часто не инициирует на основном ORF, поэтому синтез GCN4 низок. При дефиците аминокислот изменяется состояние инициационных факторов (особенно eIF2), что влияет на способность рибосомы повторно инициировать трансляцию: в условиях голодания вероятность инициирования на основном ORF возрастает, и клетка начинает активно синтезировать GCN4, который затем включает транскрипцию генов аминокислотного биосинтеза. Здесь важно видеть общую логику: сначала регуляция на уровне трансляции повышает уровень транскрипционного фактора, а затем уже этот фактор перестраивает транскрипционный профиль клетки.

Помимо uORF, трансляция регулируется структурами 5’-UTR, IRES-элементами (в некоторых контекстах), кэп-зависимыми механизмами и белками, связывающими UTR и влияющими на посадку рибосомы. Поэтому трансляционный контроль — это «быстрый рычаг» изменения экспрессии, который особенно важен в стресс-ответах.

Регуляция активности уже действующего транскрипционного фактора: включение/выключение без синтеза новых белков

Отдельно выделяют контроль «действующего» транскрипционного фактора, то есть белка, который уже синтезирован, но может быть неактивен или ограничен в способности входить в ядро, связываться с ДНК или рекрутировать коактиваторы. Этот уровень регуляции особенно эффективен, потому что обеспечивает максимально быстрый ответ: достаточно изменить модификацию или локализацию белка.

Одним из главных механизмов является контроль через лиганды. Классический пример — ядерные рецепторы, которые становятся активными транскрипционными факторами только после связывания гормона (стероид,

ретиноид и т. п.). Лиганд вызывает конформационные изменения, которые меняют партнёров белка: вместо корепрессоров начинают рекрутироваться коактиваторы, и ген включается.

Важное следствие: клетка может держать рецептор «наготове» и запускать транскрипцию сразу после появления сигнала.

Другой крупный механизм — ковалентные модификации, прежде всего фосфорилирование. CREB является классическим примером: сам белок может присутствовать в ядре, связываться с CRE-элементом, но активной транскрипцию делает фосфорилирование, позволяющее рекрутировать коактиватор CBP/p300. Это демонстрирует принцип: ДНК-связывание и транскрипционная активация — разные функции, и клетка может регулировать именно «активационную» часть.

Очень показателен контроль через секвестрирование и ядерную локализацию. NF-κB в неактивном состоянии связан с ингибитором IκB и удерживается в цитоплазме. При сигнале IκB модифицируется и деградирует, NF-κB высвобождается, быстро перемещается в ядро и запускает транскрипцию генов иммунного и стрессового ответа. Здесь принципиально, что регуляция осуществляется не на уровне синтеза NF-κB, а на уровне его доступности к ДНК. Ещё один важный механизм — контроль через деградацию и стабилизацию белка. Многие транскрипционные факторы имеют короткий период полужизни и постоянно синтезируются и разрушаются; усиление или подавление убиквитинпротеасомного пути резко меняет их концентрацию и активность. Это особенно характерно для факторов, которые должны быстро включаться и быстро исчезать, чтобы не вызывать патологически длительные изменения транскрипции.

Наконец, существует механизм внутримембранного протеолиза, превращающий мембранные предшественники в ядерные транскрипционные факторы. SREBP синтезируется как мембранный белок ЭПР; при изменении уровня липидов запускается протеолиз, высвобождающий N-концевой фрагмент, который входит в ядро и активирует транскрипцию генов липидного обмена. Notch работает по схожему принципу: сигнал от соседней клетки приводит к последовательному протеолитическому расщеплению, и внутриклеточный домен Notch становится ядерным регулятором транскрипции. В учебниковой логике это примеры того, как клетка использует протеолиз не как «утилизацию», а как способ активации сигнального фактора.

Вопрос 14 «Примеры контроля активности транскрипционных факторов на уровне транскрипции, процессинга, времени полужизни, трансляции мРНК, действующего транскрипционного фактора»

Вопрос 15 «Кэпирование пре-мРНК»

Вопрос 16 «Сплайсинг пре-тРНК: канонические и неканонические интроны.»