Билеты к экзамену

Вопрос 1 «Транскрипция. Определение, механизм, субстраты, матрицы, ферменты, продукты.»

Транскрипция − это фундаментальный процесс экспрессии генов, представляющий собой синтез молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) на матрице дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В ходе этого процесса генетическая информация, хранящаяся в последовательности нуклеотидов ДНК, "переписывается" в комплементарную последовательность РНК, создавая рабочие копии генов. Эти копии в виде матричной РНК (мРНК) будут использованы для синтеза белка, а другие типы РНК (рибосомальная, транспортная и др.) выполнят структурные и функциональные роли в клетке.

Механизм транскрипции является циклическим и включает три строго последовательные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На всех этапах ключевую роль играет фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, которая движется вдоль ДНК, расплетает двойную спираль и катализирует образование фосфодиэфирных связей между рибонуклеотидами.

Субстратами для реакции синтеза РНК служат четыре вида рибонуклеозидтрифосфатов (рНТФ): аденозинтрифосфат (АТФ), уридинтрифосфат (УТФ), гуанозинтрифосфат (ГТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Энергия, необходимая для полимеризации, заключена в макроэргических связях этих молекул.

Матрицей для синтеза всегда выступает одна из цепей молекулы ДНК,

именуемая матричной (или антикодирующей) цепью. Именно ее нуклеотидная последовательность определяет порядок присоединения комплементарных рибонуклеотидов (А=У, Т=А, Г≡Ц, Ц≡Г). Продуктом же является цепь РНК, комплементарная этой матрице и идентичная (с заменой Т на У) второй, кодирующей цепи ДНК.

Промотор (часто содержащий TATAбокс) сначала связывается фактор транскрипции TFIID, ключевым компонентом которого является TBP (TATA-binding protein). Затем к комплексу последовательно присоединяются другие общие факторы транскрипции (TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH),

формируя преинициаторный комплекс.

Только после сборки этого многокомпонентного комплекса к нему рекрутируется РНК-полимераза II (ответственная за синтез мРНК).

Факторы транскрипции − это белки, которые, не обладая каталитической активностью РНК-полимеразы, абсолютно необходимы для регуляции: они обеспечивают правильное позиционирование фермента на старте гена, способствуют раскручиванию ДНки (как геликаза в составе TFIIH) и фосфорилированию "хвоста" РНК-полимеразы II, что служит сигналом для перехода к элонгации.

TFIID − ключевой фактор сборки преинициирующего комплекса (PIC). Имеет два домена: TATA-связывающий белок (TBP) и связанные с ним факторы (TAFs).

TFIIH − центральный GTF сборки PIC, обладает свойствами киназы и геликазы. Способствует локальному распадению ДНК, чтобы могла начаться транскрипция.

BRE − расположен до TATA-бокса. Связывает фактор TFIIB, помогая правильно сориентировать комплекс. DPE, DCE и MTE − расположены после точки старта транскрипции. Характерны для промоторов без TATA-бокса. Связываются с TAFсубъединицами комплекса TFIID, выполняя аналогичную TATA-боксу якорную функцию для стабилизации комплекса на ДНК.

Субстратом на этой стадии выступает первый рибонуклеозидтрифосфат (часто пурин − АТФ или ГТФ), который образует инициирующий комплекс.

Продуктом инициации является стабильный комплекс инициации с первыми 2-10 соединенными нуклеотидами РНК, после чего у прокариот σ-

фактор высвобождается, а у эукариот большинство факторов транскрипции отсоединяются.

II.Элонгация

После диссоциации σ-фактора (у прокариот) или факторов инициации (у эукариот) РНК-полимераза переходит в конформацию, активную для перемещения. Фермент (кор-РНК-полимераза у прокариот или РНК-полимераза II с фосфорилированным С-концевым доменом у эукариот) продвигается вдоль матричной цепи ДНК, раскручивая ее примерно на один виток впереди себя и позволяя спирали восстанавливаться позади. На этой стадии к растущему 3'-концу цепи РНК фермент последовательно присоединяет комплементарные субстраты − рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ). Каждое присоединение сопровождается отщеплением пирофосфата (РРi), что делает реакцию необратимой.

Таким образом, продуктом стадии элонгации является непрерывно растущая цепь первичного транскрипта РНК, которая временно образует гибридную дуплексную структуру с матричной ДНК на коротком участке внутри транскрипционного пузыря.

III.Терминация

Синтез РНК продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит

(интринсическая) терминация происходит, когда в транскрипте формируется шпилечная структура из Г-Ц пар, за которой следует ряд уридиловых остатков; это приводит к отсоединению РНК и фермента. При ρ-зависимой терминации вспомогательный белок ρ-фактор (хеликаза), двигаясь вдоль синтезированной РНК, догоняет полимеразу, остановившуюся на терминаторе, и вызывает диссоциацию комплекса.

У эукариот терминация для РНК-полимеразы II тесно связана с посттранскрипционным событием − полиаденилированием. После того как в синтезируемую РНК встраивается сигнальная последовательность AAUAAA, специальный комплекс белков осуществляет ее эндонуклеолитическое

хвоста длиной 150-200 остатков. Само же расщепление РНК служит сигналом, который приводит к диссоциации РНК-полимеразы II от матрицы ДНК. Таким образом, конечным продуктом стадии терминации является отсоединенная цепь первичного транскрипта и высвобождение РНК-полимеразы.

Вопрос 2 «Структурно-функциональная организация прокариотических РНК-полимераз. Структура и функции субъединиц α, , ’, . Типы и функции субъединиц.»

Вопрос 3 «Инициация транскрипции у прокариотов.»

Вопрос 4 «Структурно-функциональная организация эукариотических РНКполимераз»

Вопрос 5 «Организация промоторов у прокариотов и эукариотов.»

Вопрос 6 «Роль цис-элементов и транс-факторов в организации процессов транскрипции»

Цис-элементы: коровые (главные) элементы промотора.

специфических активаторных белков. Активатор, связавшийся с UAS, рекрутирует коактиваторы и медиатор, что приводит к усилению транскрипции целевого гена. Может работать на некотором расстоянии.

Транс-факторы - компоненты базальной машины транскрипции.

Вопрос 7 «Инициация транскрипции эукариотической РНК-полимеразы II (сборка базальной машины транскрипции)»

1.Распознавание промотора комплексом TFIID

•Комплекс TFIID первым связывается с ядром промотора. Его ключевая субъединица TBP встраивается в малую бороздку ДНК, специфически

субъединицы TFIID, которые связываются с другими элементами: Inr, DPE, DCE.

•TFIIA стабилизирует связывание TFIID с ДНК, выступая как антирепрессор.

2.Рекрутирование TFIIB и формирование DAB-комплекса

•TFIIB связывается одновременно с TBP и с ДНК, взаимодействуя с элементами, расположенными как выше (BREu), так и ниже (dBRE) TATAбокса.

•Функция TFIIB критична: Он выступает в роли "молекулярного моста", который, во-первых, еще больше стабилизирует комплекс TFIID на ДНК, а во-вторых, и это главное, создает специфическую площадку для последующего связывания Pol II. TFIIB задает полярность комплекса и определяет направление транскрипции.

3.Привлечение РНК-полимеразы II с "помощником" TFIIF

•Pol II не может присоединиться к промотору сама по себе. Она доставляется в комплекс в виде преформированного "модуля" Pol II–TFIIF.

•TFIIF выполняет несколько функций: (а) облегчает доставку Pol II к промотору, (б) способствует ее стабильному связыванию, (в) препятствует неспецифической адгезии Pol II к ДНК в других местах.

4.Завершение сборки комплекса: присоединение TFIIE и TFIIH

•TFIIE присоединяется к растущему комплексу и служит рекрутером и регулятором следующего критического фактора — TFIIH.

•TFIIH — это многофункциональный белковый комплекс с ферментативной активностью, "мотор" инициации. Он содержит две ключевые активности: o АТФ-зависимая хеликаза (субъединицы XPB, XPD): Использует

энергию АТФ для расплетания двойной спирали ДНК вокруг точки старта транскрипции, формируя транскрипционный пузырь (~13

п.н.).

o Киназная активность (субъединица CDK7): Фосфорилирует C- концевой домен (CTD) РНК-полимеразы II. CTD состоит из множественных гептадных повторов (YSPTSPS). факторов инициации (TFIIB, TFIIE, TFIIH).