17. Сплайсинг интронов группы I, II, ядерных пре-мРНК. Альтернативный сплайсинг, транс-сплайсинг.

Аутосплайсинг

Интроны группы I - ауторибозимы, способные к аутосплайсингу. Встречаются в предшественниках мРНК, рРНК, тРНК; Обнаружены у разных организмов (низших эукариотов: простейшие, грибы, митохондрии грибов, хлоропласты высших растений, фаги (Т4), бактерии); Первым описан интрон рРНК Tetrahymena thermophila (26S рРНК содержит короткий интрон длиной 413 н.);

Сами они выпиливаться не могут, им нужны все-таки помощники. Ионы: K1+, Mg2+, или Mn2+. G, GMP, GDP и GTP могут быть ко-факторами – только они и никто другой. В ходе реакции гуанозин включается в молекулу РНК: присоединяется ковалентно к 5’-концу вырезанного интрона. Энергия для реакции не нужна, нужна только 3’-OH группа гуанозина. In vivo нужны белки-помощники. Видимо, “сам решу…” для них не совсем работает.

Тут обязательно нужно сказать про области спаривания, которые формируют участки для сплайсинга. По сути это просто комплементарные взаимодействия. Например, P1, который будет дальше рассмотрен, состоит из части Exon1 и интрона. Таких областей 9, и они выполняют разные функции. Р4 и Р7 – консервативные участки; Р1 – создается из 3’-SS левого экзона и 5’-SS (splicing site) интрона, спаривающегося с экзоном (IGS, internal guide sequence, (5-SS)); Р9– спаривается с концом интрона и правым экзоном; P3, P4, P6, P7– необходимы для каталитической активности; Р7 и Р9 очень сближены (2 н.); Р7 спаривается с последовательностью, содержащей реактивный гуанозин (3-SS интрона) – гуанозин связывающий сайт

Для того, чтобы осуществлять реакцию сплайсинга у интронов 1 группы есть два особых сайта: субстрат-связывающий сайт и гуанозин-связывающий сайт. Посмотрим на этапы сплайсинга для интронов 1 группы.

В гуанозин-связывающий сайт приходит G-OH, в субстрат-связывающем сайте стоит часть 5’-экзона. Фиолетовым цветом показан Exon2, над субстрат связывающим сайтом на левой верхней картинке показан Exon1. Внешне-пришедший гуанозин атакует фосфодиэфирную связь после уридина, и занимает его позицию в последовательности розовой петли с 5’ конца.

Далее происходит перенос гуанозина с 5’-конца Exon2 в гуанозин связывающий сайт, атака со стороны оборвавшегося 3’-конца Exon1, и выщепление последовательности

Exon1-Exon2.

Закольцовываем образовавшийся интрон. Для этого в последовательности розовой после гуанозина стоит участок, который попадает в субстрат-связывающий сайт. Происходит атака гуанозином из гуанозин-связывающего сайта по оборвавшемуся концу с выщеплением короткого линейного интрона и закольцовывание большого фрагмента интрона.

Интроны группы I формируют 3D-структуру, содержащую каталитический центр и места для реализации двух реакций трансэтерификации. Правильный фолдинг интрона группы I определяет его способность к самосплайсингу, но не энергия АТФ, или ГТФ. После вырезания интроны группы I сохраняют каталитическую активность.

Интроны группы II - также, как и интроны группы I, являются мультидоменными РНК, обладающими рибозимной активностью. Ненуждаются в экзогенном гуанозине; Для реакции необходимы ионы Mg2+; 5’-SS и 3’-SS имеют консенсусные последовательности: GUGYG и AY, соответственно; Сплайсинг происходит через образование лассо-подобной структуры в сайте ветвления: UACUAAC, расположен в интроне на расстоянии нескольких н. upstream от 3’-SS. Последовательность сайта

ветвления Py(80)NPy(80)Py(87)Pu(75)A(100)Py(95) консервативна; Т.о., интроны группы II содержат цис-элементы, которые расположены на границах экзон/интрон и интрон/экзон, а также сайт ветвления; 2’-ОН группа А в сайте ветвления выполняет функцию нуклеофила, атакующего (3’,5’)-фосфодиэфирную связь в 5’-SS интрона Сплайсинг включает 2 реакции трансэтерификации:

1.​ Аденин сайта ветвления разрывает связь на границе экзон/интрон и образует

2’→5’ связь

2.​ 3’(ОН)-группа экзона атакует 3’-SS и образует 3’→5’ связь

Интрон сворачивается в «колесо с шестью радиальными спицами» (d1-6). Важны d1, d5

и d6. Спаривание в IBS1 (Intron binding site)/ERS1 (exon recognition site) и IBS2/EBS2

структурно выделяют 5-SS. 3-SS сближается с А в сайте ветвления.

Интроны группы II in vitro самовырезаются (аутосплайсинг) при относительно высокой ионной силе; При физиологических условиях (in vivo) необходимы вспомогательные белки; Отличия сплайсинга интронов группы II от сплайсинга интронов группы I: (1) не нужен кофактор (2) оформлены цис-элементы (3) предусматривается образование лассо подобной структуры в сайте ветвления

Ядерные пре-мРНК почти все интронированы. Содержат в среднем 7–8 экзонов на транскрипт. Средняя длина экзона 100-200 н. (10– 400 н.). Средняя длина интрона 1 т.н. Пре-мРНК относится к короткоживущей гетерогенной ядерной РНК (hnRNA). hnRNP–РибоНуклеоПротеид = hnRNA + белки. 5-SS и 3-SS идентичны у всех интронов пре-мРНК. Любой 5-SS может узнавать любой 3-SS. Сайты сплайсинга универсальны. Аппарат сплайсинга не обладает тканевой специфичностью. Сплайсинг пре-мРНК in vitro происходит пост-транскрипционно без кэпа и поли(А)+. Сплайсинг пре-мРНК in vivo происходит координировано с другими модификациями. Сплайсинг происходит через образование лассо-подобной структуры (как самосплайсинг у интронов группы 2, схема идентична).

Сплайсосома – динамичная нуклеопротеиновая структура, которая последовательно собирается на пре-мРНК. Она реорганизуется в ходе катализа, осуществляет катализ, разбирается после удаления интрона.

Белки сплайсосомы вовлекаются в сплайсинг, выполняют структурные и энзиматические функции. Малые ядерные (U)-РНК являются главными ферментами (рибозимами) сплайсинга и входят в сплайсосому. Их 5 штук (U1, U2, U4, U5, U6).

Общая схема сплайсинга пре-мРНК на рисунке снизу.

Альтернативный сплайсинг позволяет их одного транскрипта создавать несколько зрелых мРНК для получения разных белков. Кратко и понятно это показано на схеме ниже. Взяли транскрипт, вырезали интроны, а экзоны можно теперь соединить так как хочется для того чтобы получить кодирующую последовательность для трансляции с нее последовательности белка A или белка B. Экзон не опознается и включается в состав интрона из-за: дефицита SR-белков, присутствия белков, связывающихся с ESS, вырожденных сигналов сплайсинга, мутаций в сигналах сплайсинга. Ткане-/ сексспецифический, онтогенетически обусловлен, «Неуправляемый» (инволюция молочной железы), позволяет изменять локализацию белка (закреплять его в мембране за счет трансмембранных доменов, выводить из клетки за счет сигнальных последовательностей и т.д.).

Транс-сплайсинг позволяет соединять экзоны из разных пре-мРНК транскриптов. Рисунок поможет все понять…