12. Элонгация транскрипции.
У прокариот и у эукариот процесс удлинения растущей цепи мРНК в общих чертах протекает одинаково. РНК-полимераза сдвигается с промотора, перемещается вдоль двойной спирали ДНК в направлении 3'→5', раскручивает спираль перед участком, на котором происходит синтез РНК. На короткое время образуется, так называемый, «открытый» комплекс, внутри которого возникает гибридная спираль ДНК-РНК длиной порядка 20 нуклеотидов. Синтез мРНК идёт согласно принципу комплементарности, затем фермент вновь закручивает ДНК за участком полимеризации. Синтез транскрипта прерывист, периоды быстрой элонгации перемежаются краткими паузами, во время которых активный участок полимеразы подвергается некоторой структурной перестройке. Паузы редко продолжаются более чем 6 миллисекунд и могут сопровождаться обратным перемещением полимеразы по матрице. Выведение РНК-транскрипта из комплекса осуществляется через особый канал на РНК-полимеразе.
Различия элонгации прокариот и эукариот заключаются в длине синтезируемого транскрипта. Самые длинные прокариотические транскрипты несколько тыс. п.н. в длину, могут быть транскрибированы в течение нескольких минут (скорость полимеризации несколько сот нуклеотидов в мин). В генах эукариот обычно присутствует большое количество интронов, должны быть скопированы отрезки значительной длины. Например, на синтез пре-мРНК гена дистрофина человека длиной 2 400 тыс. п.н. тратится порядка 20 часов (скорость полимеризации до 2 000 н. в мин).
Размеры генов эукариот предъявляют особые требования к устойчивости комплекса транскрипции. В ядре клетки работают факторы элонгации — белки, которые соединяются с полимеразой после того, как она освободила промотор и оставила позади факторы инициации транскрипции. У млекопитающих известно о тридцати факторах элонгации. Важность этих факторов демонстрируют мутации, нарушающие их работу. Например, инактивация фактора CSB (подавляет паузы РНК-полимеразы) приводит к развитию синдрому Кокейна — болезни, сопровождающейся пороками развития, задержкой умственного развития.
Ядерные полимеразы эукариот должны преодолевать нуклеосомы, которые присоединены к транскрибируемой матричной ДНК. Факторы элонгации способны модифицировать структуру хроматина. Например, у млекопитающих фактор FACT взаимодействует с гистонами H2A и H2B, по-видимому, влияя на расположение нуклеосом.
Схема РНК-связывающих участков рибосомы. Буквами обозначены участки связывания тРНК. А — аминоацил-тРНК-связывающий участок, Р — пептидил-тРНК-связывающий участок, Е — участок отсоединения тРНК от рибосомы
На этапе элонгации тРНК, комплементарная второму кодону на мРНК и несущая аминокислоту, поступает в А-сайт рибосомы. Между формилметионином, находящемся в Р-сайте рибосомы, и аминокислотой, доставленной тРНК в А-сайт, в пептидилтрансферазном центре образуется пептидная связь. После образования пептидной связи, полипептид оказывается связанным с тРНК, которая находится в А-сайте. Далее происходит транслокация: деацилированная формилметионил-тРНК перемещается из Р-сайта в Е-сайт, пептидил-тРНК перемещается из А-сайта в Р-сайт, мРНК продвигается на один кодон. Этот процесс сопровождается затратами энергии (ГТФ), также у нём участвует специальный транслокационный белковый фактор (EF-G). Затем тРНК, комплементарная следующему кодону мРНК, связывается с освободившимся А-сайтом рибосомы, происходит повторение выше описанных этапов, с каждым циклом полипептид удлиняется на один аминокислотный остаток
13. Терминация транскрипции.
Терминация — это завершающий этап транскрипции, на котором происходит остановка синтеза РНК и диссоциация транскрипционного комплекса (РНК-полимеразы, ДНК-матрицы и новосинтезированной РНК).
У бактерий выделяют два основных типа терминации, различающихся по участию специальных белков:
Rho-независимая (истинная) терминация: Модель характеристического терминатора
– шпилька (5-20 н.п) не требует участия доп факторов. Состоит из (GC)-богатой области палиндрома, за которой следует тракт поли-Т в нематричной нити ДНК (что дает поли-U участок в РНК). Отличия от сигнала паузы: шпилька ближе к polyU, сразу после шпильки не меньше U3 (детекция терминатора). Шпилька нарушает контакты РНК с полимеразой и укорачивает РНК-ДНК гибрид. Поскольку гибрид сам по себе непрочен, комплекс самопроизвольно разрушается, и РНК освобождается, Терминаторная шпилька предохраняет транскрипт от 3’-экзонуклеаз. Около половины генов E. coli имеют такие терминаторы.
Rho-зависимая терминация: Rho-фактор – белок терминации: консервативный белок прокариотов, имеет длину 419 а.о. (45 кДа), обладает РНК-зависимой АТФ-азной и геликазной активностью. N-конец (1-115 белок а.о.) связывается с РНК, С-конец имеет сайты связывания и гидролиза АТФ (РНК-зависимая АТФ-аза). Ключевым элементом является сайт rut (Rho utilization) — C-богатая последовательность длиной 50–90 нуклеотидов, расположенная выше терминатора.
Механизм: Rho-фактор связывается с сайтом rut, формирует кольцо вокруг РНК и движется в сторону РНК-полимеразы, используя энергию АТФ. Догнав полимеразу, он помогает завершить транскрипцию за счет своей геликазной активности.
Механизмы эукариот изучены меньше и различаются для разных типов РНК-полимераз (РНКП):
Сайты терминации для РНКП II не установлены : возможно, используются Rho-подобные белки: в системе in vitro Rho-факторы осуществляют терминацию, если в ДНК введен rut-сайт, − Rho-фактор не влияет на освобождение РНКП I и РНКП III, − Фактор 2 у насекомых (154 кДа), связывается с элонгирующим комплексом и вызывает АТФ-зависимое освобождение РНКП II, то есть, обладает свойствами РНК-зависимой АТФазы (подобно Rho-фактору).
Сайт терминации у РНКп1 состоит из 2х элементов: 5'-элемент (5'-element): Это тракт тимидинов длиной 10–12 нуклеотидов (н.) в нешаблонной цепи, которому в мРНК соответствует последовательность AUUUUGUCU (U богатая). РНК-полимераза временно останавливается на этом участке. 3'-элемент (3'-element): Это сайт связывания транс-фактора Reb1, расположенный примерно в 11 н. ниже 5'-элемента. Остановка РНК-полимеразы на 5'-элементе и последующее взаимодействие с белком Reb1, связанным с 3'-элементом, приводит к диссоциации РНК-полимеразы и завершению транскрипции.
Процесс терминации может регулироваться клеткой для контроля экспрессии генов:
Антитерминация: Это снижение эффективности или полное устранение терминации. Она может быть процессивной (игнорируются все терминаторы на пути) или непроцессивной (игнорируется только ближайший).
Антитерминатор - сигнал антитерминации (цис элементы), расположенные перед терминатором.
Механизм антитерминации заключается в модификации РНК-полимеразы белковыми факторами, что делает её недоступной для контактов с белком Rho.
Аттенюация: Используется для регуляции оперонов синтеза аминокислот (например, триптофанового оперона). В начале оперона расположен Rho-независимый терминатор.
Механизм основан на способности РНК формировать альтернативные структуры (шпильки): в зависимости от условий либо образуется терминаторная шпилька и синтез прекращается (образуется короткая лидерная РНК), либо терминатор не образуется и транскрипция продолжается.
14. Примеры контроля активности транскрипционных факторов на уровне транскрипции, процессинга, времени полужизни, трансляции мРНК,
действующего транскрипционного фактора.
Контроль экспрессии генов в клетке редко сводится к простому принципу «есть транскрипционный фактор — значит ген включён». В действительности клетка располагает многоуровневой системой регуляции, которая позволяет точно дозировать экспрессию во времени, пространстве и по интенсивности. Особенно важно, что регуляция может быть реализована не только на уровне синтеза РНК (транскрипции), но и на последующих стадиях: обработке (процессинге) транскрипта, определении его стабильности и времени полужизни, эффективности трансляции, а также на уровне активности уже синтезированного транскрипционного фактора. Такой многоступенчатый контроль делает регуляцию одновременно гибкой и надёжной: клетка может запускать быстрые ответы без ожидания синтеза новых белков, может «гасить» сигнал на любом этапе, а также может комбинировать регуляторные входы для создания сложной логики экспрессии.
Регуляция на уровне транскрипции: управление скоростью инициации и сборкой транскрипционного комплекса
Регуляция на уровне транскрипции означает изменение вероятности и/или скорости инициации транскрипции конкретного гена. В эукариотах она обычно реализуется через связывание транскрипционных факторов с энхансерами и промоторными элементами, привлечение коактиваторов или корепрессоров, модификацию хроматина
иизменение эффективности сборки базальной машины Pol II. В прокариотах аналогичный контроль реализуется через доступность промотора для РНК-полимеразы
ивзаимодействие с активаторами/репрессорами в области оператора.
Хороший пример транскрипционного контроля — факторы семейства SOX. Эти белки содержат HMG-домен и часто действуют как регуляторы программ развития и дифференцировки. Их роль не ограничивается «включением» промотора: SOX-белки нередко выполняют архитектурную функцию, изменяя локальную геометрию ДНК и создавая условия для кооперативной посадки других факторов. В результате транскрипция целевых генов становится возможной только в тех клетках и в те моменты, где одновременно присутствует нужный набор партнёров (например, POU-факторы), коактиваторы и «открытое» состояние хроматина. Таким образом, контроль SOX на уровне транскрипции — это пример комбинаторной логики: сам фактор может присутствовать, но без правильного контекста активной транскрипции не будет.
Другой типичный пример — метаболически и стресс-зависимая регуляция транскрипции через специфические промоторные элементы и активируемые сигнальными путями транскрипционные факторы. В таких случаях клетка меняет экспрессию набора генов, переключаясь между программами роста, ответа на повреждение, адаптации к дефициту субстратов. В рамках учебной логики важно подчеркнуть: транскрипционный контроль позволяет «экономить» ресурсы, поскольку
предотвращает синтез ненужных транскриптов и белков, но он не всегда самый быстрый — поэтому клетка дополняет его посттранскрипционными механизмами.
Регуляция на уровне процессинга: сплайсинг и формирование «вариантов смысла» из одного транскрипта
Даже если транскрипция уже запущена, экспрессию можно радикально изменить на стадии процессинга. Главный механизм здесь — альтернативный сплайсинг, при котором из одного и того же пре-мРНК образуются разные зрелые мРНК, кодирующие различные белковые изоформы. Это принципиально важный уровень регуляции для многоклеточных организмов, так как он многократно увеличивает разнообразие протеома без увеличения числа генов.
Процессинговый контроль может менять не только аминокислотную последовательность белка, но и наличие/отсутствие ключевых доменов: домена ДНК-связывания, домена димеризации, сигналов ядерной локализации, мотивов взаимодействия с коактиваторами. В результате одна изоформа может быть активным транскрипционным фактором, а другая — доминант-негативным ингибитором, который связывает партнёра, но не активирует транскрипцию. С точки зрения регуляции это чрезвычайно выгодно: клетка может быстро переключать функциональный результат экспрессии гена, изменяя работу сплайсосомы и сплайсинг-факторов, не затрагивая саму транскрипцию.
К процессинговому контролю следует отнести и альтернативное использование сайтов полиаденилирования, меняющее длину 3’-UTR. Хотя это формально относят к 3’-процессингу, функционально эффект часто проявляется как «сплайсинг по смыслу»: укороченная или удлинённая 3’-UTR изменяет число сайтов для микроРНК и РНК-связывающих белков, тем самым меняя стабильность и трансляцию транскрипта.
Регуляция времени полужизни мРНК: стабильность как «усилитель» или «глушитель» сигнала
Время полужизни мРНК определяет, как долго транскрипт будет доступен для трансляции. Два гена могут транскрибироваться с одинаковой скоростью, но давать совершенно разные уровни белка, если одна мРНК живёт часы, а другая — минуты. Поэтому контроль стабильности — это мощный способ тонко настраивать экспрессию, особенно в быстрых ответах на стресс или сигнал.
Классические механизмы регуляции стабильности включают наличие cis-элементов в 3’-UTR (например, AU-богатых участков), которые распознаются РНК-связывающими белками. Эти белки могут либо защищать мРНК от деградации, либо, наоборот, рекрутировать комплексы deadenylation и decapping, ускоряя разрушение транскрипта. МикроРНК образуют ещё один важнейший слой: они направляют комплексы подавления экспрессии к комплементарным участкам 3’-UTR, вызывая деградацию мРНК или торможение трансляции.
Функционально контроль стабильности особенно важен, когда клетке нужно быстро убрать транскрипт после завершения ответа. Например, мРНК факторов воспаления, стресс-ответа и некоторых регуляторов клеточного цикла часто имеют короткий период полужизни, чтобы сигнал не «перетекал» во времени и не становился хроническим.
Регуляция на уровне трансляции: управление синтезом белка без изменения уровня мРНК
Трансляционный контроль позволяет клетке быстро менять синтез белка даже при неизменном количестве мРНК. Это особенно важно в стрессовых условиях, когда общая трансляция может подавляться, но синтез избранных белков, напротив, должен усиливаться. Одним из наиболее наглядных учебных примеров является регуляция трансляции транскрипционного фактора GCN4 у дрожжей.
МРНК GCN4 содержит в 5’-нетранслируемой области несколько коротких upstream ORF (uORF). В нормальных условиях рибосома инициирует трансляцию на uORF и после завершения часто не инициирует на основном ORF, поэтому синтез GCN4 низок. При дефиците аминокислот изменяется состояние инициационных факторов (особенно eIF2), что влияет на способность рибосомы повторно инициировать трансляцию: в условиях голодания вероятность инициирования на основном ORF возрастает, и клетка начинает активно синтезировать GCN4, который затем включает транскрипцию генов аминокислотного биосинтеза. Здесь важно видеть общую логику: сначала регуляция на уровне трансляции повышает уровень транскрипционного фактора, а затем уже этот фактор перестраивает транскрипционный профиль клетки.
Помимо uORF, трансляция регулируется структурами 5’-UTR, IRES-элементами (в некоторых контекстах), кэп-зависимыми механизмами и белками, связывающими UTR и влияющими на посадку рибосомы. Поэтому трансляционный контроль — это «быстрый рычаг» изменения экспрессии, который особенно важен в стресс-ответах.
Регуляция активности уже действующего транскрипционного фактора: включение/выключение без синтеза новых белков
Отдельно выделяют контроль «действующего» транскрипционного фактора, то есть белка, который уже синтезирован, но может быть неактивен или ограничен в способности входить в ядро, связываться с ДНК или рекрутировать коактиваторы. Этот уровень регуляции особенно эффективен, потому что обеспечивает максимально быстрый ответ: достаточно изменить модификацию или локализацию белка.
Одним из главных механизмов является контроль через лиганды. Классический пример
— ядерные рецепторы, которые становятся активными транскрипционными факторами только после связывания гормона (стероид, ретиноид и т. п.). Лиганд вызывает конформационные изменения, которые меняют партнёров белка: вместо корепрессоров начинают рекрутироваться коактиваторы, и ген включается.
Важное следствие: клетка может держать рецептор «наготове» и запускать транскрипцию сразу после появления сигнала.
Другой крупный механизм — ковалентные модификации, прежде всего фосфорилирование. CREB является классическим примером: сам белок может присутствовать в ядре, связываться с CRE-элементом, но активной транскрипцию делает фосфорилирование, позволяющее рекрутировать коактиватор CBP/p300. Это демонстрирует принцип: ДНК-связывание и транскрипционная активация — разные функции, и клетка может регулировать именно «активационную» часть.
Очень показателен контроль через секвестрирование и ядерную локализацию. NF-κB в неактивном состоянии связан с ингибитором IκB и удерживается в цитоплазме. При сигнале IκB модифицируется и деградирует, NF-κB высвобождается, быстро перемещается в ядро и запускает транскрипцию генов иммунного и стрессового ответа. Здесь принципиально, что регуляция осуществляется не на уровне синтеза NF-κB, а на уровне его доступности к ДНК.
Ещё один важный механизм — контроль через деградацию и стабилизацию белка. Многие транскрипционные факторы имеют короткий период полужизни и постоянно синтезируются и разрушаются; усиление или подавление убиквитин-протеасомного пути резко меняет их концентрацию и активность. Это особенно характерно для факторов, которые должны быстро включаться и быстро исчезать, чтобы не вызывать патологически длительные изменения транскрипции.
Наконец, существует механизм внутримембранного протеолиза, превращающий мембранные предшественники в ядерные транскрипционные факторы. SREBP синтезируется как мембранный белок ЭПР; при изменении уровня липидов запускается протеолиз, высвобождающий N-концевой фрагмент, который входит в ядро и активирует транскрипцию генов липидного обмена. Notch работает по схожему принципу: сигнал от соседней клетки приводит к последовательному протеолитическому расщеплению, и внутриклеточный домен Notch становится ядерным регулятором транскрипции. В учебниковой логике это примеры того, как клетка использует протеолиз не как «утилизацию», а как способ активации сигнального фактора.