11. Двух- и трехгибридные дрожжевые системы.
На основе взаимозаменяемости модулей из разных транкрипционных факторов создан метод оценки белок-белковых взаимодействий: двухгибридная дрожжевая система (иначе - дрожжевая двугибридная система скрининга (yeast two-hybrid screen))
Метод использует модульную природу белков-активаторов генов (см. рис. 7.45). Эти белки связываются со специфической последовательностью ДНК и активируют транскрипцию гена, причем эти функции обычно выполняют различные домены белка.
Рис. 7.45. Модульная структура белка-активатора. Схема опыта, позволяющего
выявить в составе белка-активатора Gal4 у дрожжей независимые ДНК-связывающие и активирующие транскрипцию домены. Функциональный активатор может быть
получен при соединении C-концевой части белка Gal4 дрожжей и ДНК-связывающего
домена бактериального регуляторного белка (белок LexA) методами генной инженерии. Когда этот бактериально-дрожжевой гибридный белок будет
синтезироваться в клетках дрожжей, он будет активировать транскрипцию дрожжевых генов, если перед этими генами встроить специфический участок, обеспечивающий его
связывание с ДНК. а) В норме белок Gal4 отвечает за активацию транскрипции генов
дрожжей, кодирующих ферменты, которые превращают галактозу в глюкозу. б) Чтобы
химерный регуляторный белок, созданный методами генной инженерии, активировал
транскрипцию, в контролирующей области должна присутствовать распознаваемая LexA последовательность. В описанном опыте контролирующая область одного из генов, регулируемых белком LexA, слита с геном LacZ E. coli , который кодирует фермент β-галактозидазу. β-галактозидазу очень просто определить биохимическими методами, что очень удобно для мониторинга уровня экспрессии, который задается контролирующей областью гена. Здесь LacZ используется в качестве репортерного гена, так как он «докладывает» об активности контролирующей области гена.
При помощи метода рекомбинантных ДНК два таких белковых домена используют для создания отдельных химерных белков — «наживки» и «добычи». Для конструирования белка-«наживки» последовательность ДНК, кодирующую интересующий белок, сшивают с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен белка-активатора гена. Когда такую конструкцию вводят в дрожжи, клетки начинают синтезировать химерный белок, состоящий из интересующего белка и ДНК-связывающего домена (рис. 8.24). Этот белок связывается с регуляторным участком репортерного гена, где служит в качестве «наживки» для ловли белков, взаимодействующих с интересующим белком. Для поиска потенциальных белков-партнеров (потенциальной «добычи» на «наживку») возможные кандидаты также должны представлять собой химерные белки: ДНК,
кодирующая активирующий домен белка-активатора гена, сшивается с большим
количеством различных генов. Отдельные гены из этого набора, кодирующие потенциальную «добычу», поодиночке вводят в клетки дрожжей, содержащие
«наживку». Если дрожжевая клетка получает клон ДНК, экспрессирующий
белок-«добычу» для белка-«наживки», то две половинки активатора транскрипции
соединяются и включают ген-репортер (см. рис. 8.24).
Этот остроумный метод кажется сложным, но двугибридные системы относительно легко применять в лаборатории. Несмотря на то что белок-белковые взаимодействия происходят в ядре дрожжевой клетки, так можно исследовать белки из любой части клетки и любого организма. Cозданы двойные гибридные системы, позволяющие создать схему взаимодействий между всеми белками, синтезирующимися в организме. В данном случае для каждого белка конструируются химерные белки «наживки» и
«добычи», что позволяет наблюдать любую комбинацию этих белков. При помощи
этого метода созданы карты взаимодействий большинства белков дрожжей, круглого червя C. elegans и мушки Drosophila.
Рис. 8.24. Дрожжевые двойные гибридные системы для обнаружения белок-белковых
взаимодействий. Интересующий белок сшивают с ДНК-связывающим доменом,
направляющим химерный белок к регуляторной области репортерного гена в качестве «наживки». Когда в ядре клетки этот белок связывается с другим специально
сконструированным белком («добычей»), их взаимодействие приводит к объединению
двух половинок активатора транскрипции, который затем запускает экспрессию
гена-репортера.
Элементы двухгибридной дрожжевой системы:
В качестве ДНК-связывающего домена используют:
•BD домен белка Gal4 (локализуется в ядре, т.к. содержит NLS);
•Бактериальный белок LexA (не содержит NLS, однако, эффективно транспортируется в ядро).
•Оба белка связываются со специфическими сайтами ДНК (UAS Gal или LexA операторами) в виде димеров.
Также используют активирующие домены:
•Сильный AD белка Gal4;
•Очень сильный AD белка P16 вируса герпеса;
•Слабый бактериальный AD B42.
Репортерные гены:
• lacZ – позволяет количественно (по величине бета-галактозидазной активности) оценить взаимодействия между белками.
• HIS3/LEU2/URA3 - гены, кодирующие ферменты, необходимые для синтеза определенной аминокислоты или урацила. На среде, не содержащей гистидин или лейцин, вырастают только те клоны, в которых в результате взаимодействия двух гибридных белков активируется транскрипция репортерного гена.
Трёхгибридная дрожжевая система – это вариация двухгибридной дрожжевой
системы.
Данный метод основан на тех же принципах, что и двугибридная система, с той
разницей, что белки А и Б не взаимодействуют друг с другом непосредственно. Между
ними есть третий элемент — вещество Х. Этим веществом может служить молекула ДНК или РНК, малый органический лиганд, ингибитор, ковалентно связывающийся с
активным центром фермента. Метод позволяет выявить НК-белковые взаимодействия, ферментативную активность по отношению к данному субстрату, взаимодействие белка с малыми молекулами.
