8. Особенности транскрипции эукариотических РНК-полимераз I и III (организация промоторов и сборка базальной машины транскрипции).

аргинином и лизином, за счет чего связываются с ДНК \3 спираль с большой канавкой, 1 с малой). В сумме гомеодомен состоит примерно из

60 ак.

POUдомен - консервативный ДНК-связывающий мотив, обнаруженный в семействе ТФ, которые регулируют развитие и дифференцировку клеток, особенно нервной системы.

Расшифровка названия: POU=Pit -Oct-Unc Pit-1 - гипофизарный специфический ТФ

Oct-½- ТФ, связывающийся с октамерным мотивом

Unc-86- ген, контролирующий развитие нейронов у нематод.

POUдомен состоит из двух доменов: POUспецифического и POUгомеодомена, первый отвечает за высокую специфичность к определенной последовательности на ДНК, второй отвечает за связь с ДНК.

POUдомен присутствует в ТФ у животных.

ЦИНКОВЫЕ ПАЛЬЦЫ \ZNF, ZINC FINGER\

домен (подобие петли длиной 23 а.о.), выступающий над поверхностью белка благодаря консервативной последовательности, содержащей в классическом случае 2 Гистидина и 2 цистеина \С2Н\,2 образуется тетраэдрический координационный центр, координирующей атом Zn и формирующей основание Zn-пальца. Мотивы цинковых пальцев располагаются тандемно 2-10 мотивов подряд. С-конец мотива образует альфа-спираль, взаимодействующую с одним поворотом большой канавки ДНК. Цинковые пальцы взаимодействуют с ДНК, РНК и белками.

Типы цинковых пальцев:

Мотив цинковые пальцы встречается в ядерных рецепторах - белки, взаимодействующие с гормонами (стероидные, тиреоидные, ретиноиды) и с ДНК и , как следствие, регулирующие транскрипцию определенных генов.

Структура ядерного рецептора:

А/В – активирующий домен, зависимый от гормона С – цинковый палец \DBD\

D – шарнир – сигнал ядерной локализации Е – гормон-связывающий домен

F– активирующий домен, независимый от гормона Второй тип цинковых пальцев \С4\

Такой тип цинковых пальцев взаимодействует с HREпоследовательностями - гормон-ответные элементы в ДНК, к которым присоединяются ядерные рецепторы.

P-box - три АК, которые определяют специфичность связывания с определенными HREпоследовательностями

D-box - участвует в димеризации и образовании контактов с сахаро-фосфатным скелетом ДНК.

ЛЕЙЦИНОВАЯ ЗАСТЕЖКА (bZIP, LEUCINE ZIPPER\

Лейциновая застежка - амфифильная альфа спираль, способная к димеризации и содержащая лейцин каждые 7 аминокислот 4 раза.

При димеризации ТФ формируется У-образная структура, способная к взаимодействию с ДНК.

Пример ТФ, содержащих мотив лейциновая застежка: c-fos, c-jun в

АР1, CREB\

МОТИВ СПИРАЛЬ-ПЕТ ЛЯ-СПИР АЛЬ (bHLH)

Состоит из 40-60 ак. Представлен двумя амфифильными альфа спиралями по 15-16 АК, разделенные петлей из 3-25 АК. Одна из спиралей богата лизином и аргинином, за счет чего способна к взаимодействию с ДНК.

Данный мотив встречается в ТФ, регулирующих дифференцировку клеток.

Примеры:MyoD, Pho4, Max-Myc.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ДНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Набор R-групп а.о. контактирует с основаниями и скелетом ДНК;Важны водородные связи и гидрофобные взаимодействия;В сайтах узнавания образуется 10-20 водородных связей;Контакт чаще локализован в большой канавке спирали ДНК.

Контакты с пуринами более важны, чем контакты с пиримидинами;В контактах с остовом ДНК участвуют водородные связи с фосфодиэфирными кислородами;

Во взаимодействии ДНК-белок принимают участие молекулы воды в координационной сфере.

10.Регуляция инициации транскрипции. Активаторы, коактиваторы, энхансеры-энхансосомы, репрессоры, сайленсеры, сайленсосомы.

Для избирательной инициации транскрипции нужны цис-элементы и тф. Цис-элементы инвариантны во всех клетках данного организма, но их доступность для тф для одного и того же гена в разных клетках может отличаться. Регулировать экспрессию гена можно путем регуляции транскрипции тф и контролем над их активностью. Дифференциальная экспрессия гена зависит от сочетания доступности цис-элементов, принадлежащих данному гену, и активности тф, узнающих эти цис-элементы и связывающихся с ними. Комбинация этих возможностей управляется внеклеточными и внутриклеточными сигналами. Т.о., дифференциальная экспрессия генов управляется уникальной эпигенетической информацией.

UAS (upstream activating sequence) - 5’-Активаторные последовательности,

расположенные с 5’-стороны от минимального промотора:

●​ проксимальные UAS располагаются примерно от-100 до -200 п.н. от SST

●​ дистальные UAS располагаются от TSS на расстоянии до нескольких тысяч пар нуклеотидов в любой ориентации (и влево и вправо). Их называют энхансерами. Enhance (усиливать с английского).

Активаторы это модульные белки. Минимальный набор модулей включает: домен связывания с ДНК (BD, binding domain) и домен связывания с РНК-пол (AD, activating domain); многие ТФ содержат домены димеризации и мультимеризации (например, транскрипционный фактор Gal4 является положительным регулятором экспрессии генов, индуцированных галактозой. Его домены показаны на схеме снизу); некоторые ТФ содержат домен связывания с малыми молекулами (циклический АденозинМоноФосфат, цАМФ, например). Зачем нужны активаторы? Ну собственно увеличивать уровень экспрессии какого-то гена. Энхансосомы это белки, которые связываются с последовательностью ДНК - энхансером дабы увеличить уровень экспрессии гена.

Из примеров здесь можно привести дрожжевые двойные гибридные системы для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Интересующий белок сшивают с ДНК-связывающим доменом, направляющим химерный белок к регуляторной области репортерного гена в качестве «наживки». Когда в ядре клетки этот белок связывается с другим специально сконструированным белком («добычей»), их взаимодействие приводит к объединению двух половинок активатора транскрипции, который затем запускает экспрессию гена-репортера (источник: учебник Альбертса по молекулярной биологии, Том 2)

Коактиваторы - это белки, которые помогают активаторам. Здесь мы рассматриваем медиаторы. Медиаторы связывают разные белки-транскрипционные факторы и полимеразу между собой в правильной конформации для взаимодействия с ДНК (источник: учебник Альбертса по молекулярной биологии, Том 2)

Из чего состоит собственно медиатор? Для млеков и дрожжей похожи. Далеко мы не ушли от них…

У него выделяют 4 части:

1.​ Голова. Стимулирует сборку преинициаторного комплекса (PIC), взаимодействует с РНКП и общими факторами транскрипции.

2.​ Средняя часть. Взаимодействует с РНКП

3.​ Хвост. Выступает из преинициаторного комплекса в upstream область. Взаимодействует с ДНК и факторами транскрипции.

4.​ Фосфорилирующий модуль. Консервативный у всех эукариотов. Присоединяется к средней части. Проявляет киназную активность по остаткам серина (S) и треонина (T). Удивительно, но может быть как активатором, так и репрессором. Когда происходит соединение с промотором Фосфорилирующий модуль (Ckm) отсоединяется.

Медиатор контролирует регуляцию генов изменяя структуру хроматина путем:

●​ ковалентных взаимодействий ●​ перестройки гистонов ●​ удаления гистонов

Теперь посмотрим, как снизить экспрессию какого-то гена. Для этого нужны ТФ которые называют сайленсосомами (на самом деле такого слова нет, а жаль… Но есть слово репрессор) - связываются соответственно со своими последовательностями ДНК

- сайленсерами.

Репрессор может работать по разному (источник: учебник Альбертса по молекулярной биологии, Том 2):

●​ конкуренция с активатором за место связывания на ДНК ●​ экранирование активирующего домена активатора

●​ прямое взаимодействие с общими факторами транскрипции, не дает собраться транскрипционному комплексу

●​ привлечение комплекса перестройки хроматина ●​ привлечение деацетилаз гистонов ●​ привлечение метилтрансфераз гистонов

Еще одна иллюстрация, на которой и активация и репрессия показаны (источник: учебник Альбертса по молекулярной биологии, Том 2)