7. Инициация транскрипции эукариотической РНК-полимеразы II (сборка базальной машины транскрипции).

Инициация транскрипции РНК-полимеразой II у эукариот — это многоступенчатый, строго регулируемый процесс сборки и запуска «базальной машины транскрипции», который обеспечивает точное распознавание промотора, локальное расплетание ДНК

ипереход к устойчивой элонгации. В отличие от прокариот, где специфичность промотора задаётся σ-фактором и сама ДНК доступна для прямого связывания фермента, у эукариот инициирование происходит в контексте хроматина и требует согласованной работы нескольких групп белков: общих (базальных) факторов транскрипции, самой РНК-полимеразы II, комплексов коактивации (в частности медиатора), а также белков, меняющих структуру хроматина. Центральным продуктом сборки является преинициаторный комплекс (PIC, pre-initiation complex), формирующийся на core-промоторе и создающий условия для правильного старта транскрипции.

1. Промотор как платформа сборки базальной машины

Эукариотические промоторы Pol II обычно описывают как модульную систему. Минимальная часть, необходимая для начала транскрипции, называется core promoter

ивключает набор элементов, которые по-разному комбинируются у разных генов. К таким элементам относятся TATA-box (часто в области около −25 относительно +1),

инициатор Inr (около точки старта), BRE (элемент распознавания TFIIB) и DPE (downstream promoter element, ниже +1). Важно, что далеко не все промоторы

содержат TATA-box; большое число «домашних» (housekeeping) генов запускается на TATA-less промоторах и использует альтернативные core-элементы и особенности

хроматиновой организации. Таким образом, core-промотор задаёт общую «геометрию»

сборки комплекса: где именно будет расположен стартовый сайт, как будут позиционированы факторы и под каким углом Pol II войдёт на ДНК.

Однако core-промотор редко действует изолированно. На уровень инициации сильно влияют проксимальные элементы (например, GCили CAAT-подобные мотивы) и, особенно, дистальные регуляторные участки — энхансеры. Именно энхансеры через связывание активаторов и привлечение коактиваторов формируют условия, при которых базальная машина собирается эффективно. Поэтому «базальная транскрипция» (работа только core-промотора и общих факторов) в живой клетке — скорее лабораторная абстракция; физиологически значимый запуск почти всегда обеспечивается интеграцией сигналов от активаторов, коактиваторов и хроматиновых ремоделеров.

2. Проблема хроматина и «подготовка» промотора

До начала сборки PIC промотор должен стать доступным. ДНК эукариот упакована в нуклеосомы, и эта упаковка может либо препятствовать, либо, в некоторых случаях, организованно направлять сборку комплекса. Открытие промоторной области

достигается сочетанием нескольких механизмов. Активаторы, связывающиеся с

энхансерами или проксимальными участками, рекрутируют коактиваторы с гистон-ацетилтрансферазной активностью (типичный пример — CBP/p300), что увеличивает ацетилирование хвостов гистонов и ослабляет их взаимодействие с ДНК. Параллельно привлекаются ремоделирующие комплексы, которые сдвигают

нуклеосомы, изменяют их состав или создают нуклеосом-свободную область (NFR) над core-промотором. Этот этап принципиален: без доступа к core-элементам общие

факторы транскрипции не могут занять свои позиции, а Pol II не может сформировать функционально активный комплекс.

3. Общие факторы транскрипции и базальная машина Pol II

Сборка преинициаторного комплекса традиционно описывается через последовательное присоединение общих факторов транскрипции (GTFs): TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE и TFIIH, а также РНК-полимеразы II. Следует подчеркнуть: «общие» не означает «одинаковые для всех генов и всегда обязательные в одном и том же порядке». Реальная сборка может быть более вариабельной (существуют альтернативные пути, предсобранные комплексы, кооперации с медиатором и др.). Тем не менее классическая схема хорошо отражает принципиальные функции каждого компонента и поэтому удобна как учебниковый каркас.

3.1. TFIID: точка привязки и интерпретатор core-промотора

Первым ключевым фактором, который задаёт «адрес» сборки, является TFIID.

Он состоит из TBP (TATA-binding protein) и набора TAFs (TBP-associated factors). TBP

узнаёт TATA-box и, связываясь с ДНК, вызывает резкий изгиб двойной спирали. Этот изгиб не просто механический эффект: он формирует узнаваемую архитектуру, по которой другие факторы ориентируются относительно точки старта.

Если TATA-box отсутствует, критическую роль берут на себя TAFs: они способны распознавать альтернативные элементы core-промотора (например, Inr и DPE) и связывать промотор в нужной конфигурации даже без TATA-зависимого «якоря».

Именно поэтому TFIID — это не только «держатель» TBP, но и комплекс, который преобразует разнообразие промоторных архитектур в общий язык для сборки PIC.

3.2. TFIIA и TFIIB: стабилизация и позиционирование

После посадки TFIID к комплексу присоединяются TFIIA и TFIIB. TFIIA усиливает стабильность взаимодействия TBP-ДНК и может противодействовать некоторым репрессорным влияниям на уровне промотора. TFIIB выполняет роль «позиционера»: он взаимодействует с TBP и ДНК рядом с промотором, узнаёт элементы типа BRE (если они присутствуют), формирует правильную ориентацию будущего входа Pol II и

участвует в определении точной области старта транскрипции. В учебниковом представлении TFIIB — один из факторов, обеспечивающих точность начала: он

«подводит» полимеразу так, чтобы активный центр оказался на правильном расстоянии от +1.

3.3. Присоединение Pol II в комплексе с TFIIF

Далее к промотору рекрутируется РНК-полимераза II обычно в комплексе с TFIIF. Это важно: TFIIF снижает неспецифическое связывание Pol II с ДНК и повышает вероятность правильной посадки именно в составе преинициаторного комплекса. Можно сказать, что TFIIF «экранирует» полимеразу от случайных контактов и

одновременно стабилизирует правильное взаимодействие с TFIIB и TFIID.

На этом этапе формируется ядро PIC: промотор уже занят TFIID/TFIIA/TFIIB, а Pol II-TFIIF зафиксирована в правильной геометрии. Однако ДНК ещё, как правило, остаётся двуцепочечной; для начала синтеза РНК требуется локальное расплетание в области старта.

3.4. TFIIE и TFIIH: открытие комплекса и «переключатель» в элонгацию

Следующим присоединяется TFIIE, который выполняет организационную и регуляторную роль — он стабилизирует комплекс и подготавливает посадку TFIIH, контролируя его активность и позиционирование.

TFIIH — критически важный фактор, потому что он объединяет две функции, без которых инициация Pol II невозможна. Во-первых, TFIIH обладает хеликазной

активностью: он расплетает ДНК в области промотора, формируя открытый комплекс, то есть транскрипционный пузырёк, в котором матричная цепь становится доступной активному центру полимеразы. Во-вторых, TFIIH содержит киназную активность, направленную на CTD-домен Pol II. Этот момент является центральным для понимания «переключения» от инициации к элонгации.

4.CTD Pol II как платформа координации инициации и процессинга

Уникальная особенность РНК-полимеразы II — наличие CTD (C-terminal domain) на крупнейшей субъединице (Rpb1), состоящего из многократных повторов гептапептида YSPTSPS. CTD действует как динамическая платформа, на которую по мере продвижения транскрипционного цикла «садятся» разные комплексы процессинга РНК. На этапе инициации TFIIH фосфорилирует CTD преимущественно по Ser5. Это событие имеет двойной смысл. С одной стороны, фосфорилирование ослабляет часть взаимодействий, удерживающих полимеразу в промоторном комплексе, тем самым помогая перейти к промоторному «побегу» (promoter escape). С другой стороны, Ser5-фосфорилирование создаёт сайты рекрутирования ферментов 5’-кэпирования, поэтому кэпирование начинается почти сразу после старта синтеза РНК, когда первые десятки нуклеотидов выходят из полимеразы.

Далее, по мере перехода в устойчивую элонгацию, меняется «код» фосфорилирования CTD: возрастает вклад Ser2-фосфорилирования (включая киназы, связанные с элонгацией), что способствует привлечению факторов сплайсинга и

3’-процессинга (полиаденилирования). Таким образом, CTD связывает в единую функциональную цепочку: сборку PIC → запуск синтеза → кэпирование → сплайсинг →

формирование 3’-конца → терминацию.

CTD часто называют «координатором судьбы транскрипта».

5.Промоторный побег, паузы и становление элонгационного комплекса

После образования открытого комплекса Pol II начинает синтезировать короткие РНК-цепи. На ранних шагах возможны абортивные транскрипты — короткие фрагменты, синтез которых прерывается до того, как комплекс станет достаточно

стабильным. Переход к продуктивной транскрипции связан с промоторным побегом: полимераза отрывается от промоторных контактов, часть факторов инициации либо

диссоциирует, либо перестраивает взаимодействия, и формируется элонгационный комплекс.

Даже после побега Pol II часто проходит через стадию регулируемого паузирования вблизи промотора. Это паузирование является важной точкой контроля экспрессии генов: оно позволяет интегрировать сигналы регуляторов и обеспечить готовность

транскрипта к корректному процессингу. С точки зрения механики транскрипции пауза

связана с перестройкой комплекса и изменением набора факторов вокруг Pol II; с

точки зрения регуляции — это «контрольный пункт», который определяет, будет ли транскрипция продолжена в полную длину.

6. Роль медиатора и специфических регуляторов

Хотя базальная машина описывается через GTFs и Pol II, в физиологической регуляции почти всегда участвует медиатор — крупный коактиваторный комплекс, который связывает активаторы (на энхансерах и проксимальных элементах) с Pol II и

общими факторами. Медиатор способствует сборке PIC, стабилизирует

взаимодействия и облегчает переход к продуктивной транскрипции. При этом активаторы могут не взаимодействовать напрямую с Pol II; вместо этого они «передают» сигнал через медиатор и коактиваторы, изменяя вероятность сборки и эффективности инициации. Это объясняет, почему энхансеры могут находиться

далеко: петлеобразование ДНК сближает активаторы с медиатором и PIC, превращая пространственно разнесённые элементы в единую функциональную систему.