5.Организация промоторов у прокариотов и эукариотов.
Промотор - это участок ДНК, ответственный за связывание с РНК-полимеразой.
Промотор прокариот. Промотор имеет 2 консервативные последовательности: 1)боксПрибнова или -10 последовательность. Состоит из 6 или 7 пар оснований.последовательность «-10» является тем участком, с которого начинается раскручивание двойной спирали ДНК. В состав этого бокса наиболее часто входят основания ТАТААТ. Такая последовательность оснований чаще всего встречается в промоторах прокариот, ее называют консенсусной.2)-35 последовательность. Состоит из 9 нуклеотидов-отвечает за узнавание промотора РНК-полимеразой.У прокариот наряду с промотором имеются и другие регуляторные участки: это активатор и оператор.
Промотор эукариотических генов, узнающийся РНК-полимеразой промотор содержит два базовых регуляторных элемента: 1)ТАТА-последовательность (положение -25) (Хогнесса бокс, ТАТА-бокс) В состав ТАТА-бокса входят аденин и тимин, между которыми имеются только две водородные связи, что облегчает расплетание цепей ДНК в этом районе промотора. В случае замен пар оснований в указанных последовательностях промотора нарушается эффективность и правильное определение точки начала транскрипции, с которой фермент РНК-полимераза начинает синтез РНК. 2) специфическую нуклеотидную последовательность, обогащенную пиримидинами в положении -75 (см. ЦААТ-бокс). – влияет на специфичность транскрипции.
6.Роль цис-элементов и транс-факторов в организации процессов
транскрипции.
Бактериальная РНК-полимераза вместе со своим σ-фактором может двигаться вдоль ДНК, находить промотор и связываться с ним. РНК-полимераза эукариот не может считывать последовательность ДНК.
Для инициации транскрипции в клетках эукариот необходимо большое количество факторов, которые до связывания РНК полимеразы с матрицей должны провзаимодействовать с определенными цис-элементами (последовательность ДНК).
Эти факторы называют основными факторами транскрипции(белки, которые связываются с цис-элементами). Затем РНК-полимераза связывается с комплексом, который факторы образуют с ДНК. Область, в которой находятся все перечисленные компоненты, называют основным (коровым) промотором. Она содержит сайты связывания, необходимые для посадки и функционирования РНК-полимеразы.
Транскрипционные факторы необходимы для инициации транскрипции, но впоследствии не требуются. За распознавание промотора отвечают дополнительные факторы, а не сами РНК-полимеразы. Для всех эукариотических РНК-полимераз факторы создают такую структуру на промоторе, чтобы она могла быть распознана ферментом. Транскрипционный фактор обеспечивает тканеспецифичный контроль активации промотора или группы промоторов, содержащих общую целевую последовательность.
Цис-элементы - это специфические последовательности нуклеотидов в составе самой молекулы ДНК, которые определяют, где и с какой интенсивностью будет происходить синтез РНК.
Главные цис элементы прокариотических промоторов:
Район -10 (Прибнов-бокс / TATAAT): Ключевой элемент у бактерий, где начинается расплетание двойной спирали ДНК для создания «транскрипционного пузыря».
Район -35 (TTGACA): Служит для первичного узнавания и прочного связывания РНК-полимеразы. Дистанция между -35 и -10 критична для правильной ориентации фермента.
UP-элемент: Расположен «выше» района -35. Он взаимодействует с α-субъединицами РНК-полимеразы, многократно усиливая транскрипцию (часто встречается в генах рРНК).
Промотор прокариот:
Главные и не очень цис элементы эукариотических промоторов:
TATA-бокс: Аналог бактериального -10, определяет точное место сборки преинициаторного комплекса.
Inr (Инициатор): Последовательность, охватывающая точку старта (+1). Она помогает зафиксировать первый нуклеотид будущей РНК.
DPE (Downstream Promoter Element): Находится «ниже» точки старта. Важен для промоторов, у которых отсутствует ТАТА-бокс.
МТЕ – мотив 10, локализуется по ходу транскрипции в 20–30 нукл от СТТ, ~2000 промоторов дрозофилы имеют МТЕ, вместе с Inr вместо DPE, сочетается и с ТАТА-боксом.
Цис-элемент В – участок ДНК, узнаваемый TFIIB (TFIIB recognition element) – состоит из 2х субэлементов BREu и BREd (G/C G/C G/A C G C C), элементы, фланкирующие ТАТА-бокс, работают только с ТАТА-боксом.
ЭЛЕМЕНТЫ, ДОСТАТОЧНЫЕ ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ БЕЗ INR ИЛИ ТАТА-БОКСА
XCPE1 - X Core Promoter Element 1, 10 п.н.-8→+2.
ХСРЕ2 - X Core Promoter Element 2, 11 п.н., . Найдены в промоторе гена Х вируса гепатита В, у человека 1% генов содержит эти элементы
UAS – элементы, усиливающие промотор: GC бокс (GGGCGCC) и/или СААТ-бокс
(GGCCAATCT).
Промотор эукариот:
Еще раз про функции: Элементы корового (основного) промотора, такие как Inr (инициатор) и ТАТА-бокс, указывают точное местоположение первого нуклеотида (+1), с которого начнется транскрипция.
Уникальные последовательности в районах -10 (Прибнов-бокс) и -35 у бактерий или блоки DPE, MTE и DCE у эукариот позволяют клетке «сортировать» гены по группам (например, гены теплового шока или азотного обмена). Дополнительные элементы, такие как UP-элемент (у бактерий) или UAS, GC-бокс и CAAT-бокс (у эукариот), служат «усилителями», привлекая больше белков для более активной работы гена. Наличие различных цис-элементов позволяет одному и тому же гену по-разному реагировать на разные внешние условия.
Транс-факторы — это белки, которые синтезируются отдельно от целевого гена, свободно перемещаются по клетке и специфически связываются с цис-элементами.
Направленная доставка фермента: общие факторы транскрипции (TFIIB, TFIID у
эукариот) «узнают» свои цис-элементы и физически сажают РНК-полимеразу на нужный участок ДНК.
Механизм: Цис-элементы создают структурный каркас и «информационное поле» на ДНК. Транс-факторы считывают эту информацию, обеспечивая избирательность: в каждый момент времени работают только те гены, для которых в клетке есть активные соответствующие транс-факторы.
Транс факторы РНКп1: Фактор, связывающий ядро промотора, состоит из четырех белков (его называют SLl, TIF-BP или RiЫ у различных видов). Один из этих: белков, ТАТА-связывающий белок (ТВР), также необходим для инициации РНК-полимеразами II и III. Фактор SL 1 в основном отвечает за то, чтобы РНК полимераза располагалась на стартовой точке правильным образом. Для инициации с высокой частотой необходимо участие дополнительного фактора UBF. Это отдельный полипептид, связывающийся с G-С-богатым элементом на UPE. Фактор UBF выполняет две функции: способствует высвобождению промотора РНК-полимеразой и стимулирует SLI (UBF связывается с малой бороздкой ДНК и закручивает ДНК на поверхности белка в петлю почти на 360°, что приближает ядро и UPE друг к другу. Это позволяет UBF оказывать стимулирующее действие на связывание SLl с промотором.)
Транс факторы РНКп2: Эти главные факторы называют ТF II Х, где - буква-идентификатор собственно фактора. Для РНК-полимеразы II позиционирующим фактором является TF11D. Он состоит из ТВР, связанного с другими субъединицами, которые называются TAF (TBP-associated factoгs). Количество этих факторов может достигать 14. ТВР имеет необычное свойство - он связывается с ДНК в малой бороздке (почти все известные ДНК связывающие белки связываются с большой бороздкой)
Транс факторы РНКп3: ТFIIIА и ТFIIIС - факторы сборки, чья роль состоит в том, чтобы помочь TFIIIB связаться с нужным участком. Как только ТFIIIВ свяжется с ДНК, TFIIIА и TFIIIC можно удалить с промотора (высокой концентрацией соли in vitro) без какого-либо влияния на инициацию транскрипции. TFIIIВ остается связанным в районе стартовой точки, и его присутствия достаточно, чтобы РНК-п3 связалась с промотором. ТFIIIВ - единственный истинный фактор инициации, необходимый РНК-п3.
Цис элементы: эффективность транскрипции значительно возрастает в присутствии элементов PSE (proximal sequence element) и ОСТ (называется так потому, что в его составе есть последовательность, состоящая из 8 пар оснований). Факторы, связывающиеся с этими элементами, действуют совместно.