19. Примеры регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции.

(Я привела почти все примеры что были вроде как связаны с транскрипцией, не думаю, что обязательно будет выписывать их все, но почитать полезно!)

Регулировать экспрессию гена можно путем регуляции транскрипции ТФ и контролем над их активностью.

Дифференциальная экспрессия гена зависит от сочетания доступности цис-элементов, принадлежащих данному гену, и активности ТФ, узнающих эти цис-элементы и связывающихся с ними Комбинация этих возможностей управляется внеклеточными и внутриклеточными сигналами.

Транс факторы могут быть активаторами (лучше способствуют транскрипции) и репрессорами (ингибируют транскрипцию).

Примеры регуляции на уровне транскрипции:

Полное подавление активности генов гомеобокс белков в постэмбриональном периоде: гомеодомен белка Antennapedia, связанный с ДНК, состоит из трех альфа-спиралей, одна из которых (Helix 3) ложится непосредственно в большую бороздку ДНК, распознавая специфические последовательности. В норме эти гены активны во время эмбрионального развития, определяя, где будут находиться те или иные органы. В постэмбриональном периоде их активность в большинстве тканей должна быть полностью подавлена, чтобы сохранить стабильность строения тела. Если ген гомеобокс-белка (например, Antennapedia) не подавляется вовремя или активируется не в том месте, происходят гомеотические трансформации - например, у мухи вместо антенн на голове вырастают полноценные ноги.

SOX (РЕГУЛЯЦИЯ БЕЛКОМ, НАХОДЯЩИМСЯ В РЕГУЛЯТОРНОМ КАСКАДЕ НА БОЛЕЕ ВЫСОКОМ УРОВНЕ) – регуляция белком, находящимся на более высоком уровне в регуляторном каскаде (регулон супероксидного стресса). Активность SOxR определяют железосерные кластеры на N конце (если Fe2+ нет активации, если Fe3+ белок способен формировать открытый комплекс для активации транскрипции).В активной форме SoxR действует как активатор транскрипции, связываясь с промотором гена SoxS и стимулируя его экспрессию. SoxS — это другой белок-транскрипционный фактор. В свою очередь, он является регулятором широкого спектра генов, участвующих в антиоксидантной защите. Активный белок SoxS связывается с промоторами множества целевых генов, образуя так называемый регулон SoxS, и активирует их транскрипцию.

CREB (ПРИСУТСТВИЕ В ПРОМОТОРЕ СОБСТВЕННОГО ГЕНА СВОИХ ЦИС-ЭЛЕМЕНТОВ) - Энхансер (регуляторная область) гена, кодирующего CREB (cAMP response element-binding protein), содержит цис-элементы (СRE) для связывания

CREB. Повышенный уровень цАМФ связывается с Протеинкиназой А (Protein Kinase A), активируя ее. Активная Протеинкиназа А (PKA) перемещается в ядро и фосфорилирует неактивный белок CREB (добавляет фосфатную группу 'P'). Стимуляция собственного синтеза: Ассоциация активного комплекса P-CREB + CBP с элементами CRE в промоторе собственного гена CREB активирует его собственную транскрипцию. Результат: CREB стимулирует синтез самого себя в ответ на образование цАМФ. Это обеспечивает быстрое и сильное усиление ответа на стимул. Клетка может усиливать и поддерживать свой ответ на сигнал, используя положительную обратную связь для увеличения количества самого регуляторного белка. (Регуляция через Фосфорилирование )

Пролиндегидрогеназа (ауторегуляция) – фермент, катализирует превращение пролина в глутаминовую кислоту (у эукариот). Репрессор гена putA, который кодирует сам фермент (пролидегидрогеназу) – ауторегуляция. Если в среде есть пролин, то связывание пролина приводит к конформационным изменениям в PutA. В этой форме PutA теряет способность связываться с промотором генов putA и putP. Синтезируется больше фермента PutA и транспортного белка PutP, что позволяет клетке активно поглощать и использовать пролин. Если в среде нет Пролина, то PutA находится в своей активной форме, Активный PutA связывается с промоторной областью, которая регулирует транскрипцию putA и putP. PutA действует как репрессор, блокируя

инициацию транскрипции. Происходит Подавление экспрессии, поскольку пролин отсутствует, и нет необходимости производить фермент для его распада.

Ауторегуляция - Регуляция, где сам белок-продукт гена контролирует его собственную транскрипцию, что является формой контроля по принципу обратной связи

(КЛЕТОЧНО-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ/ РЕПРЕССИЯ) NF-A1/NF-A2: Оба белка содержат POU-домен - это консервативный участок, ответственный за высокоспецифичное связывание с ДНК. Эти факторы распознают и связываются с определенной последовательностью нуклеотидов в промоторах или энхансерах генов - октамером ATGCAAAT (OCTA-элемент).

NF-A1 (Oct-1): Является «вездесущим» (убиквитарным) фактором. Он обнаруживается практически во всех типах клеток организма.

NF-A2 (Oct-2): Является тканеспецифичным. В норме он активно экспрессируется в B-лимфоцитах. Его главная задача - стимуляция экспрессии генов иммуноглобулинов (Ig), что критически важно для иммунного ответа.

Механизм на примере синтеза иммуноглобулинов: В B-лимфоцитах: Присутствует фактор NF-A2. Он связывается с октамерным элементом в промоторе гена иммуноглобулина, привлекая РНК-полимеразу и другие белки, что запускает активную транскрипцию и синтез антител (IgG). В клетках HeLa (эпителиальные клетки):В норме эти клетки не синтезируют иммуноглобулины, так как в них отсутствует специфический фактор NF-A2. Несмотря на то что сам ген Ig в ДНК присутствует, его промотор остается неактивным.

Notch рецепторы - Связывание Delta с Notch-рецептором индуцирует эндоцитоз комплекса Delta-фрагмент Notch-рецептора в сигнализирующей клетке. Это связывание активирует расщепление в сайте 2 (вблизи плазматической мембраны). Фрагмент, оставшийся после расщепления в сайте 2, становится субстратом для гамма-секретазы (протеазный комплекс), которая осуществляет расщепление в сайте 3. Это расщепление происходит внутри плазматической мембраны (внутримембранный протеолиз, RIP). В результате расщепления в сайте 3 высвобождается внутриклеточный домен Notch (ICN - Notch Intracellular Domain). ICN является активным транскрипционным фактором. В ядре Связывание ICN с RbpSUH превращает комплекс из репрессора в активатор.

(Регуляция через связывание с маленькими лигандами) цАМФ: цАМФ ВЫЗЫВАЕТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ, КОТОРОЕ ИЗМЕНЯЕТ СРОДСТВО ТФ К КО-АКТИВАТОРУ; Когда глюкозы мало, уровень цАМФ в клетке растет. сАМР(цАМФ) – катаболитный регулятор, связывается с САР (белок активатор катаболизма). У CAP, не связанного с сАМР, сродство к CREB низкое (Ка=105 М-1), после связывания с сАМР Ка=5х1010 М-1, то есть сродство к CREB повышается в 100000 раз. Если цАМФ мало, то CAP не активен и РНК-полимераза не может эффективно начать транскрипцию lac-генов. Если цАМФ много, то комплекс CAP-цАМФ садится на ДНК, он помогает РНК-полимеразе прочно закрепиться на промоторе в результате - оперон включен.

IPTG (изопропил-b-D-тиогалактозид) аналог аллолактозы: он связывается с Lac-репрессором и снижает его сродство к оператору в 1000 раз. В отличие от природной лактозы, IPTG не расщепляется ферментами клетки, поэтому он поддерживает ген в постоянно «включенном» состоянии.

Репрессор Trp-оперона (58 кДа, ген trpR) подавляет экспрессию оперона после триптофаном – Trp ко-репрессор. Если триптофана мало: репрессор неактивен и не может связаться с ДНК. РНК-полимераза синтезирует ферменты для создания триптофана. Если триптофана много: он связывается с репрессором, активирует его, и этот комплекс садится на оператор, блокируя путь РНК-полимеразе. Гены выключены.

(Регуляция за счет связывания с ионами металлов) ТФ АсеI (Activator of CUP1 Expression)– регулятор активности гена металлотионеина у дрожжей (CUP1). После связывания с атомами Cu(I) Асе1 изменяет конформацию и связывается с MRE ДНК, и привлекает транскрипционный аппарат для защиты клетки от токсичных металлов.

Регуляция за счет связывания с непептидными гормонами: В отсутствии гормона рецептор (GR) связан в цитоплазме с шаперонами (HSP90/70/40), которые маскируют его сигнал ядерной локализации. Как только гормон связывается с рецептором, шапероны освобождаются, рецептор перемещается в ядро и связывается с элементом HRE на ДНК для активации транскрипции.

Ковалентные модификации обратимые модификации (фосфорилирование,дефосфорилирование,окисление восстановление S-S связей в белке).: фосфорилирование - Присоединение фосфатной группы (обычно к остаткам серина, треонина или тирозина) меняет заряд и конформацию транскрипционного фактора, что может как активировать его, так и заблокировать.

Окисление / восстановление S–S-связей (SoxR, OxyR) - Система SoxR (Реакция на супероксид-анион): механизм используется бактериями для защиты от окислительного стресса (активных форм кислорода). В неактивном состоянии белок SoxR содержит восстановленные железосерные кластеры [2Fe-2S]^{2+}. При появлении свободных радикалов (O_2^) кластеры окисляются до [2Fe-2S]^{3+}. Это изменение структуры «включает» белок, и он запускает транскрипцию гена soxS, продукты которого защищают клетку. Система OxyR (Реакция на перекись водорода): Белок OxyR в восстановленном состоянии неактивен. Под действием H2O2 между специфическими остатками цистеина (SH группы) образуются дисульфидные мостики (S-S). Окисленный (активный) OxyR связывается с ДНК и запускает экспрессию антиоксидантных генов (например, каталазы katG). Процесс обратим: с помощью системы глутаредоксина (GSH) белок может вернуться в неактивное состояние.

Адаптивный ответ, модификация белка Ada: Неактивный белок Ada связывается с MPE и необратимо переносит метильную группу с MPE на цистеин в своем N-концевом домене. белок становится метилированным Ada. Эта модификация не активирует его транскрипционную активность, но она является первым шагом в сенситизации. Метилированный или неметилированный Ada связывается с O^6-MeG и необратимо переносит метильную группу с O^6-MeG на цистеин в своем C-концевом домене. Образуется дважды метилированный Ada. Именно эта модификация делает Ada активным транскрипционным фактором (ТФ). Активный метилированный Ada (Me-Ada) связывается с

промоторами (например, промотором ada) и активирует транскрипцию генов, составляющих адаптивный ответ.

Подавление деградации - HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor 1) — это ключевой транскрипционный фактор, который активируется при гипоксии (пониженном содержании кислорода). При нормальном уровне кислорода (Normoxia), белок HIF-1alpha быстро деградирует. Белок pVHL является субъединицей Е3-убиквитинлигазы. Связавшись с HIF-1alpha-OH, pVHL метит его молекулой убиквитина (Ub). Убиквитинированный HIF-1alpha немедленно отправляется на протеасомную деградацию. Когда уровень кислорода снижается (Hypoxia), происходит подавление деградации HIF-1alpha. Без убиквитинирования HIF-1$\alpha$ стабилизируется и быстро накапливается в цитоплазме. Гетеродимер HIF-1alpha-HIF-1beta связывается с коактиваторами (например, p300/CBP) и запускает транскрипцию генов, необходимых для адаптации к гипоксии.

Секвестрирование ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ У ПРОКАРИОТОВ - Пролиндегидрогеназа кодируется геном PutA (белок PutA). В присутствии пролина PutA/ФАДН2 (фермент гидрофобен) связан с мембраной и работает как фермент; } В отсутствии пролина PutA/ФАД (фермент гидрофилен), диссоциирует от мембраны и, находясь в свободном состоянии в цитозоле, репрессирует свой ген;

Секвестрирование ТФ на примере NF-kB: Транскрипционный фактор NF-kB (состоящий из субъединиц p50 и RelA/p65) находится в цитоплазме в комплексе с ингибиторным белком IkB. Белок IkB физически маскирует сигналы ядерной локализации NF-kB, не давая ему проникнуть в ядро. При поступлении внешнего сигнала (через рецептор на мембране) активируется фермент IKK (протеинкиназа, фосфорилирующая IkB). IKK фосфорилирует белок IkB. Фосфорилированный IkB направляется в протеасому, где полностью разрушается (деградация). Свободный димер NF-kB теперь может беспрепятственно пройти через ядерную пору в ядро. Там он связывается с регуляторными элементами (RE) целевых генов и вместе с коактиваторами запускает транскрипцию.

Внутримембранный протеолиз (SREBP). - в ответ на низкий уровень стеролов (холестерина) ТФ SREBP освобождается из мембраны ЭПР и перемещается в ядро, где активирует гены синтеза липидов. Если высокий уровень стеролов: Холестерол связывается с комплексом SCAP-SREBP. Это связывание активирует белок Insig, который прочно связывается с SCAP. Комплекс SREBP-SCAP-Insig прочно удерживается в мембране Эндоплазматического ретикулума (ЭПР). SREBP не попадает в аппарат Гольджи, не подвергается протеолизу и не активирует гены. Синтез холестерола подавлен. Если низкий стеролл: Свободный комплекс SCAP-SREBP транспортируется из ЭПР в аппарат Гольджи. Гольджи комплекс встречается с сайт1-протеазой (S1P), которая осуществляет первое отрезание SREBP. После первого отрезания, оставшийся фрагмент SREBP (который все еще заякорен) подвергается второму отрезанию сайт2-протеазой (S2P). S2P отрезает SREBP внутри мембраны (внутримембранный протеолиз). Высвобожденный SREBP перемещается в ядро, связывается с регуляторными элементами SRE в ДНК и активирует транскрипцию генов, ответственных за синтез холестерола.

(Лиза) Я думала это мой вопрос так что на всякий случай вставлю​ Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции занимает центральное место в биологии клетки,

поскольку именно на этом этапе определяется, будет ли ген вообще «прочитан» РНК-полимеразой и с какой интенсивностью будет синтезироваться РНК. С точки зрения энергетики и эффективности это наиболее выгодная стратегия контроля: клетка предотвращает появление ненужных транскриптов и белков ещё до затрат на их синтез, созревание и трансляцию. Транскрипционная регуляция реализуется через взаимодействие cis-регуляторных элементов ДНК (промоторы, операторы, энхансеры, сайленсеры и др.) с trans-действующими факторами(активаторы, репрессоры, коактиваторы, корепрессоры), а также через управление доступностью ДНК в составе хроматина. Принципиально важно, что транскрипционный контроль почти всегда носит интегративный характер: итоговый уровень транскрипции является результатом баланса активирующих и подавляющих воздействий, реализуемых множеством регуляторов, которые формируют в промоторно-энхансерной области функциональный молекулярный ансамбль.

Прокариотические модели транскрипционной регуляции: опероны, репрессия и индукция

Наиболее классические примеры транскрипционной регуляции демонстрирует прокариотическая клетка, где ДНК относительно доступна, а ключевые регуляторные решения принимаются на уровне взаимодействия РНК-полимеразы с промотором и регуляторных белков с операторными участками. Типичной формой организации является оперон — группа структурных генов, транскрибируемых с общего промотора в одну полицистронную мРНК. Это обеспечивает согласованное включение набора генов, участвующих в одном метаболическом пути или функциональном модуле.

Индуцируемая транскрипция на примере «катаболических» систем иллюстрирует принцип: пока субстрата нет, включать ферменты его расщепления невыгодно. В таких системах репрессор связывается с оператором и препятствует продуктивной инициации транскрипции. Появление индуктора приводит к конформационным изменениям репрессора, его аффинность к оператору снижается, и промотор становится доступен для РНК-полимеразы. В результате происходит транскрипция генов, обеспечивающих использование доступного субстрата. На уровне молекулярной логики это пример отрицательной регуляции, где «по умолчанию» генетическая программа выключена, а включение происходит только при наличии соответствующего метаболического сигнала.

Противоположную стратегию демонстрируют репрессируемые (обычно «анаболические») системы: ферменты синтеза продукта нужны только тогда, когда продукта мало. Здесь репрессор часто активируется не напрямую, а через корепрессор — конечный продукт пути. Когда концентрация продукта возрастает, корепрессор связывается с репрессором, формируя активный комплекс, который эффективно занимает оператор и подавляет транскрипцию. Это обеспечивает отрицательную обратную связь и поддержание метаболического гомеостаза.

Помимо репрессии, у прокариот широко распространена положительная регуляция транскрипции активаторами. В таких системах наличие активатора повышает эффективность связывания РНК-полимеразы с промотором или стабилизирует переход к открытому комплексу. В учебниковом понимании активатор выполняет роль «усилителя» промотора: он либо рекрутирует РНК-полимеразу, либо облегчает события, критичные для инициации. Важно, что активаторы часто служат точками интеграции сигнальных путей: их активность зависит от малых молекул, фосфорилирования или состояния клетки, поэтому через активатор клетка быстро перестраивает транскриптом в зависимости от условий среды.

К прокариотическим особенностям транскрипционной регуляции относится и использование альтернативных σ-факторов, которые переключают промоторную специфичность РНК-полимеразы и тем самым включают «пакеты генов» — стресс-ответ, стационарную фазу, тепловой шок, биогенез жгутиков и т.д. В этом случае регуляция осуществляется не столько на уровне одного промотора, сколько на уровне изменения набора распознаваемых промоторных мотивов всей транскрипционной машиной.

Такая стратегия особенно эффективна для быстрой адаптации: достаточно изменить доступность σ-фактора, чтобы перепрограммировать транскрипцию сотен генов.

Эукариотическая транскрипционная регуляция: энхансеры, хроматин и сборка базальной машины Pol II

У эукариот регуляция на уровне транскрипции значительно усложняется из-за двух фундаментальных причин: ДНК упакована в хроматин, а инициация Pol II требует сборки преинициаторного комплекса и участия общих факторов транскрипции. Поэтому активаторы и репрессоры у эукариот часто действуют не напрямую на РНК-полимеразу, а через изменение структуры хроматина и через коактиваторные/корепрессорные комплексы.

Одним из центральных элементов эукариотической транскрипционной регуляции является энхансер — cis-регуляторный участок, который может располагаться на большом расстоянии от промотора, в интронах или даже после гена, и при этом сохранять способность усиливать транскрипцию. Энхансер функционирует как платформа для связывания нескольких активаторов, которые кооперативно формируют сложный белковый ансамбль — энхансосому. За счёт пространственного сближения ДНК (петлеобразование) энхансер взаимодействует с промотором, а активаторы через коактиваторы и медиатор повышают вероятность сборки и стабильности преинициаторного комплекса Pol II. В результате транскрипция становится возможной только при наличии определённой комбинации факторов, характерной для конкретного типа клетки или стадии развития. Именно здесь проявляется принцип комбинаторного контроля, обеспечивающий тканевую специфичность экспрессии: один и тот

же ген может иметь разные энхансеры, активируемые разными наборами факторов, и потому включаться в разных контекстах.

Наряду с энхансерами существуют сайленсеры, на которых связываются репрессоры. В отличие от простого механического «перекрытия» промотора, характерного для многих бактериальных репрессоров, эукариотические репрессоры часто подавляют транскрипцию через перестройку хроматина. Они рекрутируют комплексы диацетилаз (HDAC) или гистоновые метилтрансферазы, что приводит к снижению ацетилирования гистонов, появлению репрессивных меток и уплотнению хроматина. В таком состоянии промотор становится недоступным для общих факторов транскрипции и Pol II, и транскрипция резко снижается. Сайленсерные комплексы (сайленсосомы) могут формировать устойчивые репрессированные состояния, что важно для дифференцировки и поддержания клеточной идентичности.

Особую роль в эукариотической регуляции играет тот факт, что активация транскрипции часто требует предварительного «открытия» хроматина. Активаторы рекрутируют коактиваторы, обладающие гистон-ацетилтрансферазной активностью (например, CBP/p300), и ремоделирующие комплексы, которые перемещают или удаляют нуклеосомы в области промотора. Лишь после этого становится возможной эффективная сборка базальной машины — комплекса TFIID/TFIIA/TFIIB/Pol II-TFIIF/TFIIE/TFIIH и переход к открытому комплексу. Таким образом, транскрипционная регуляция у эукариот часто реализуется через управление вероятностью и эффективностью сборки преинициаторного комплекса.

Сигнал-зависимые примеры транскрипционной регуляции: быстрая активация генетических программ

Особенно наглядными являются примеры, где транскрипция включается в ответ на внешний сигнал через активацию транскрипционного фактора. В таких системах транскрипционный фактор может быть синтезирован заранее, но находиться в неактивной форме до поступления сигнала. После активации он быстро перемещается в ядро или меняет способность привлекать коактиваторы и запускает транскрипцию целевых генов.

Характерный тип — гормон-зависимая регуляция через ядерные рецепторы. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения рецептора, изменение набора взаимодействующих белков и переключение от корепрессорного состояния к коактиваторному. В результате комплекс начинает рекрутировать коактиваторы, модифицировать хроматин и усиливать транскрипцию генов-мишеней. Такая схема особенно эффективна для синхронного включения больших транскрипционных программ, например метаболических или дифференцировочных.

Другой яркий пример — транскрипционный фактор NF-κB, который в покое удерживается в цитоплазме ингибитором. При поступлении сигнала ингибитор деградирует, NF-κB быстро входит в ядро и активирует транскрипцию генов иммунного и стрессового ответа. Здесь принципиально то, что клетка регулирует не синтез фактора, а его доступность к ДНК, благодаря чему транскрипционная программа запускается очень быстро.

К этому же классу относятся системы, где транскрипционный фактор активируется протеолитически. Например, мембранный предшественник может расщепляться, и его внутриклеточный фрагмент становится ядерным активатором транскрипции. Это демонстрирует тесную связь между мембранными сигналами и транскрипционным ответом, характерную для многоклеточных организмов.

Комбинаторная логика и интеграция сигналов как универсальный принцип транскрипционной регуляции

Несмотря на различия между прокариотами и эукариотами, общий принцип транскрипционного контроля можно сформулировать как интеграцию сигналов на уровне ДНК-регуляторных участков. В прокариотах это выражается в комбинировании влияний репрессоров и активаторов на доступность

промотора и эффективность инициации. В эукариотах этот принцип расширяется и включает взаимодействия энхансеров и промоторов, работу медиатора, состояние хроматина и контекст сборки преинициаторного комплекса Pol II. Итоговая транскрипционная активность гена является результатом «суммирования» множества вкладов: концентраций транскрипционных факторов, их модификаций и локализации, наличия коактиваторов/корепрессоров, архитектуры регуляторных элементов и эпигенетического состояния соответствующего локуса.

Таким образом, примеры регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции демонстрируют, что клетка использует транскрипцию не только как процесс считывания информации, но и как ключевой уровень вычисления и принятия решений. Через промоторы, энхансеры и сеть транскрипционных факторов клетка интерпретирует сигналы среды и внутренние состояния, формируя адаптивные или специализированные программы экспрессии, лежащие в основе метаболизма, ответа на стресс, развития и дифференцировки.