1.Транскрипция. Определение, механизм, субстраты, матрицы, ферменты,

продукты.

Транскрипция - это фундаментальный процесс экспрессии генов, представляющий собой синтез молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) на матрице дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В ходе этого процесса генетическая информация, хранящаяся в последовательности нуклеотидов ДНК, "переписывается" в комплементарную последовательность РНК, создавая рабочие копии генов. Эти копии в виде матричной РНК (мРНК) будут использованы для синтеза белка, а другие типы РНК (рибосомальная, транспортная и др.) выполнят структурные и функциональные роли в клетке.

Механизм транскрипции является циклическим и включает три строго последовательные стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На всех этапах ключевую роль играет фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, которая движется вдоль ДНК, расплетает двойную спираль и катализирует образование фосфодиэфирных связей между рибонуклеотидами.

Субстратами для реакции синтеза РНК служат четыре вида рибонуклеозидтрифосфатов (рНТФ): аденозинтрифосфат (АТФ), уридинтрифосфат (УТФ), гуанозинтрифосфат (ГТФ) и цитидинтрифосфат (ЦТФ). Энергия, необходимая для полимеризации, заключена в макроэргических связях этих молекул.

Матрицей для синтеза всегда выступает одна из цепей молекулы ДНК,

именуемая матричной (или антикодирующей) цепью. Именно ее нуклеотидная последовательность определяет порядок присоединения комплементарных рибонуклеотидов (А=У, Т=А, Г≡Ц, Ц≡Г). Продуктом же является цепь РНК, комплементарная этой матрице и идентичная (с заменой Т на У) второй, кодирующей цепи ДНК.

I.Инициация

компонентом которого является TBP (TATA-binding protein). Затем к комплексу последовательно присоединяются другие общие факторы транскрипции (TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH), формируя преинициаторный комплекс.

Только после сборки этого многокомпонентного комплекса к нему рекрутируется РНК-полимераза II (ответственная за синтез мРНК).

Факторы транскрипции - это белки, которые, не обладая каталитической активностью РНК-полимеразы, абсолютно необходимы для регуляции: они обеспечивают правильное позиционирование фермента на старте гена, способствуют раскручиванию ДНки (как геликаза в составе TFIIH) и фосфорилированию "хвоста" РНК-полимеразы II, что служит сигналом для перехода к элонгации.

TFIID - ключевой фактор сборки преинициирующего комплекса (PIC). Имеет два домена: TATA-связывающий белок (TBP) и связанные с ним факторы (TAFs).​

TFIIA - привлекается к сборке PIC TFIID для стабилизации комплекса.​

TFIIB - привлекается к сборке PIC после того, как к комплексу присоединится TFIIA. Находится близко к месту начала инициации транскрипции.​

TFIIF - вероятно, связывается с РНК-полимеразой, поэтому добавляется к комплексу после того, как TFIIB привлечёт РНК-полимеразу II.​

TFIIE - привлекается после TFIIF и перед TFIIH.​

TFIIH - центральный GTF сборки PIC, обладает свойствами киназы и геликазы. Способствует локальному распадению ДНК, чтобы могла начаться транскрипция.​ BRE - расположен до и после TATA-бокса. Связывает фактор TFIIB, помогая правильно сориентировать комплекс. DPE, DCE и MTE - расположены после точки старта транскрипции. Характерны для промоторов без TATA-бокса. Связываются с TAF-субъединицами комплекса TFIID, выполняя аналогичную TATA-боксу якорную функцию для стабилизации комплекса на ДНК.

Субстратом на этой стадии выступает первый рибонуклеозидтрифосфат (часто пурин - АТФ или ГТФ), который образует инициирующий комплекс.

Продуктом инициации является стабильный комплекс инициации с первыми 2-10 соединенными нуклеотидами РНК, после чего у прокариот σ-фактор высвобождается, а

уэукариот большинство факторов транскрипции отсоединяются.

I. Элонгация

После диссоциации σ-фактора (у прокариот) или факторов инициации (у эукариот) РНК-полимераза переходит в конформацию, активную для перемещения. Фермент (кор-РНК-полимераза у прокариот или РНК-полимераза II с фосфорилированным С-концевым доменом у эукариот) продвигается вдоль матричной цепи ДНК, раскручивая ее примерно на один виток впереди себя и позволяя спирали восстанавливаться позади. На этой стадии к растущему 3'-концу цепи РНК фермент последовательно присоединяет комплементарные субстраты -

рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ). Каждое присоединение сопровождается отщеплением пирофосфата (РРi), что делает реакцию необратимой.

Таким образом, продуктом стадии элонгации является непрерывно растущая цепь первичного транскрипта РНК, которая временно образует гибридную дуплексную структуру с матричной ДНК на коротком участке внутри транскрипционного пузыря.

II.Терминация

Синтез РНК продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит специфическую сигнальную последовательность терминатор. У прокариот

существуют два основных механизма. ρ-независимая (интринсическая) терминация

происходит, когда в транскрипте формируется шпилечная структура из Г-Ц пар, за которой следует ряд уридиловых остатков; это приводит к отсоединению РНК и фермента. При ρ-зависимой терминации вспомогательный белок ρ-фактор (хеликаза), двигаясь вдоль синтезированной РНК, догоняет полимеразу, остановившуюся на терминаторе, и вызывает диссоциацию комплекса.

У эукариот терминация для РНК-полимеразы II тесно связана с посттранскрипционным событием - полиаденилированием. После того как в синтезируемую РНК встраивается сигнальная последовательность AAUAAA, специальный комплекс белков осуществляет ее эндонуклеолитическое расщепление. Затем фермент поли(А)-полимераза использует в качестве субстрата АТФ для наращивания на 3'-конце РНК поли(А)-хвоста длиной 150-200 остатков. Само же расщепление РНК служит сигналом, который приводит к диссоциации РНК-полимеразы II от матрицы ДНК. Таким образом, конечным продуктом стадии терминации является отсоединенная цепь первичного транскрипта и высвобождение РНК-полимеразы.

Функции:

1.​ Инициация сборки РНКП 2.​ Участвует в узнавании промотора

3.​ Мишень для белков-регуляторов транскрипции Разные регуляторные белки взаимодействуют с разными АК на С-конце альфа СЕ.

Например, белок активатор катаболической активности САР взаимодействует с областью около 260 АК и с ДНК в downstream области.

Бета и бета штрих СЕ Самые большие СЕ, выполняют каталитическую функцию.Кодируются в разных генах,

но в одном опероне. Аналогичные субъединицы есть во всех типах РНКП (не только у прокариот). Бета штрих способна к неспецифическому связыванию с ДНК, но эта способность не способствует выполнению какой-либо функции.

Активный центр:

Вбета штрих субъединице находится сайт связывания иона магния-кофермента, который координирован фосфатными остатками и тремя Asp, связь с фосфатными остатками помогает удержать нуклеотид на 3’-конце растущей цепи РНК и вступающий с ним в реакцию нуклеозидтрифосфат в необходимом положении, что способствует протеканию реакции.

Вбета СЕ находится сайт контакта альфа-Р 3’-концевого нуклеотида РНК.

3(ОН)-основание последнего нуклеотида контактирует с бета и бета штрих СЕ.

Сайты контакта с ДНК: на N-конце бета штрих цинковые пальцы, на С-конце бета СЕ скользящий зажим.

Функции:

1.​ Связывание с ДНК; 2.​ Связывание с сигма фактором

3.​ Катализ реакции полимеризации 4.​ Связь 3’-концевого нуклеотида 5.​ Узнавание промотора

Омега СЕ Самая маленькая СЕ. Шаперон для бета штрих.

Выполняет структурную и функциональную роль.

Функциональная: поддерживает активную конформацию бета штрих СЕ. Сигма фактор Функции:

1.​ Специфическое узнавание промотора; 2.​ Стимуляция плавления двунитевой ДНК с образованием транскрипционного

пузырька.

В стандартных условиях активны сигма факторы 70, которые взаимодействуют с каноническими промоторами, характерными для генов домашнего хозяйства. В условиях стресса активируются другие сигма факторы. При азотном голодании активируется сигма фактор 54.

Канонический промотор включает:

-41 UPE: AAA(A/T)(A/T)T(A/T)TTTNNAAA (АТ-богатый) -35 блок: TTGACA

-10 блок: TATAAT

в положении +1 пурин в окружении пиримидинов

Сигма 70

Функции разных доменов сигма фактора 70: 1.1– автоингибирующий домен; 2.4 - связывается с промотором в районе -10;

4.2 –связывается с промотором в районе -35; 2.3 – богата остатками ароматических а. к., способствует разделению нитей ДНК;

1.2, 2.1 – участвуют в связывании с coreE(бета штрих);

3.0 (3.1) – необходима для связывания ДНК в области upstream -10

3.Инициация транскрипции у прокариотов.

Тезисно:

1.​ Образование холофермента 2.​ Образование закрытого комплекса

3.​ Образование открытого комплекса 4.​ Образование инициаторного комплекса (Абортивная инициация) 5.​ Синтез 7-12 нуклеотидов 6.​ Транслокация комплекса 7.​ Диссоциация сигма-фактора 8.​ Элонгация транскрипции

Подробнее:

1.ДНК-зависимая РНК полимераза - РНКП, состоящая из 5 субъединиц (альфа, альфа, бета, бета штрих, омега), связывает один из нескольких специфических сигма факторов (чаще всего сигма 70, контролирующий экспрессию генов домашнего хозяйства E.coli).

2.Этот комплекс РНКП+сигма фактор (например фермент-сигма 70) распознает промоторную область на ДНК, расположенную в координатах -35 и -10 относительно стартовой точки транскрипции (transcription start site, TSS, напомню, что это точка с координатой +1), и формирует закрытый комплекс (RNAP-promoter closed, RPc). Кроме последовательностей в областях -10 и -35 существуют дополнительные последовательности усиливающие связь между ДНКой и комплексом РНКП-сигма фактор. Они располагаются как до точки -10/-35 (upstream элементы: TG extended (EXT на рисунке), энхансеры, дискриминаторы (DSR на рисунке)), так и после -10 (downstream элементы: АТ-богатые элементы, UP).

3.RPc претерпевает несколько конформационных изменений (изомеризация) через серию переходных состояний (промежуточные комплексы RPi, intermediate) для формирования открытого транскрипционного комплекса с промотором (RPo, open). Изомеризация включает плавление водородных связей между комплементарными нуклеотидами двуцепочечной ДНК вокруг области −10 (обычно между координатами −11 и +2-+4) и образование транскрипционного пузырька длиной 12–15 нуклеотидов.

4.При наличии рибонуклеозидтрифосфатов (rNTP) RPo превращается в инициаторный транскрипционный комплекс (RPinit), формирует первую фосфодиэфирную связь между rNTPs, в координатах +1 и +2 матричной цепи ДНК, и начинает синтез РНК.

5.Во время синтеза за пределами динуклеотида RPinit, downstream область ДНК (от +2 до +15) втягивается в фермент для последующей транскрипции, что приводит к расширению транскрипционного пузырька (до ~25 нуклеотидов), в то время как контакты ДНК-РНКП в upstream области остаются нетронутыми. В то же время росту РНК-цепи мешает связь между сигма3-сигма4 регионами (σ3.2 палец), которая блокирует канал выхода РНК из транскрипционного комплекса. Биохимические данные свидетельствуют о том, что стресс, связанный со скручиванием ДНК, и, что более важно, пространственное столкновение между 5'-концом РНК и σ3–4, в совокупности вызывают абортивную инициацию (РНКП синтезирует короткие фрагменты РНК, высвобождает их и при этом не покидает промотор).

6-7. На финальной стадии РНКП синтезирует РНК определенной длины (11-15 нуклеотидов, 9 из которых связаны с ДНК, образуя ДНК-РНК гибрид в транскрипционном пузырьке), блокировка выходного канала РНК устраняется, РНКП покидает промотор, сигма фактор отсоединяется (диссоциирует). Формируется высокостабильный процессивный элонгационный комплекс.

8. Начинается стадия элонгации (дальнейшего удлинения транскрипта).

На картинке то, что описано словами выше (источник)

Ну и собственно, какие части есть у РНКП и кто с кем связывается наглядно (источник)

4.Структурно-функциональная организация эукариотических РНК-полимераз.

Вотличие от бактерий, которые располагают РНК-полимеразой одного типа, в ядрах эукариот встречается три таких фермента: РНК-полимераза I, РНК-полимераза II и

РНК-полимераза III. Эти три полимеразы структурно подобны друг другу (и ферменту бактерий) и включают в себя некоторые общие субъединицы, но транскрибируют гены разного типа.

·РНК-полимеразы I и III транскрибируют гены, кодирующие транспортную РНК, рибосомную РНК и различные малые РНК.

·РНК-полимераза II транскрибирует большинство генов, включая все те, которые кодируют белки, её и рассмотрим подробно!!

Помимо ядерных генов, у нас ещё есть митохондриальные, у них своя РНК-полимераза.

А вот и сводочка по 4м типам РНК-полимераз:

·РНКП 1 (14 СЕ) – локализуется в ядрышке и транскрибирует рРНК гены (45S пре-РНК, которая процессируется в 28S, 18S и 5.8S рРНК – рибосомная РНК) –

самая производительная РНКП по количеству

·РНКП 2 (12 СЕ) – локализуется в нуклеоплазме и транскрибирует структурные гены, образует пре-мРНК, 4 U-RNA сплайсинга, некоторые мяРНК и микроРНК –

самая производительная РНКП по качеству

·РНКП 3 (17 СЕ) – локализуется в нуклеоплазме и в ядрышке, транскрибирует гены

тРНК, 5S рРНК, различные ncRNA, найденные в цитозоле и в ядре – продуцирует

каталитическую и регуляторную РНК

И самые особенные митохондиральные полимеразы:

·мтРНКП – 2 СЕ у дрожжей (145 и 43 кДа, “core+σ”) и 1 СЕ у высших эукариотов (~140 кДа) кодируется уникальным ядерным геном и импортируется в митохондрии

– неселективная транскрипция.

Итак, РНКП 2…

Рис. 6.15. Структурное подобие между РНК-полимеразой бактерий и РНК-полимеразой II эукариот. Области этих двух РНК-полимераз, характеризующиеся подобной структурой, показаны зеленым. Полимераза эукариот крупнее, чем фермент бактерий (12 субъединиц вместо 5), и содержит некоторые дополнительные области (отмечены серым). Синие шарики — атомы цинка, которые служат структурными составляющими полимераз, а красный шарик — атом магния, расположенный в активном участке, где и

происходит полимеризация (на самом деле ионы цинка и ионы магния).

РНК-полимеразы всех современных клеток (бактерий, архей и эукариот) состоят в близком родстве, тем самым свидетельствуя о том, что основные составляющие этого фермента уже были на своем месте до расхождения этих трех главных ветвей древа жизни.

Хотя РНК-полимераза II эукариот структурно очень похожа на бактериальную РНК-полимеразу (рис. 6.15), есть несколько важных различий в способе действия этих ферментов у бактерий и эукариот, вот два из них:

1.Тогда как при инициации in vitro бактериальной РНК-полимеразе требуется только один дополнительный белок (σ-фактор), РНК-полимеразы эукариот требуют множества дополнительных белков, в совокупности именуемых общими (иногда их называют

основными) факторами транскрипции.

2.У эукариот процесс инициации транскрипции обязательно связан с упаковкой ДНК в нуклеосомы и в хроматиновые структуры более высокого порядка — особенности, которых нет в хромосомах бактерий.

Субъединичный состав РНКП2 дрожжей:

·СЕ1, СЕ2, СЕ3 (аналогична альфа-субъединице РНКП прокариот): основные субъединицы (аналог корового фермента)

·СЕ4, СЕ7: нужны, когда имеет стрессовые (субоптимальные) условия

·СЕ9 (существенна для роста при высоких и низких температурах), СЕ11: аналоги сигма-факторов

·СЕ5, СЕ6 (гомологична омега-субъединице РНКП прокариот), СЕ8, СЕ10, СЕ12: нужны непостредственно для транскрипции (общие для всех ядерных РНКП)

Ну и про мтРНКП чутчут:

Она имеет 4 домена, которые вы можете посмотреть на картинке, ингибируется рифамицином, бромистым этидием на уровне инициации транскрипции.