Funktsional'naia_biokhimiia

21

глюкозы образуется восстановленная форма кофермента НАДФ, использующаяся для восстановления глутатиона – основного компонента

сульфгидрильная группа, водород которой обеспечивает нейтрализацию органических и неорганических окислителей, действующих на мембрану эритроцита, и защищает липиды мембраны от свободнорадикального окисления.

Вышеизложенное делает очевидным большую значимость для поддержания стабильности эритроцитарной мембраны, интенсивности гликолитических реакций, обеспечивающих образование АТФ и соответственно полноценное функционирование АТФ-азных систем и трансмембранный перенос ионов, а также состояние пентозного цикла окисления глюкозы и образование достаточного количества НАДФН2.

В условиях врожденной или приобретенной недостаточности энергообеспечения эритроцитов при нарушении активности гликолитических ферментов, а также ферментов пентозофосфатного окисления глюкозы возникает дестабилизация эритроцитарной мембраны, изменение формы эритроцита и гемолиз.

Как известно, отличительными особенностями структуры и, соответственно, метаболизма эритроцитов являются отсутствие ядра, рибосомального аппарата, в связи с чем эритроциты не обладают белоксинтетической функцией. В эритроцитах отсутствуют митохондрии, система цитохромов и, соответственно, отсутствует цикл трикарбоновых кислот. Эритроцит не воспроизводит de novo нуклеиноыве кислотиы и липиды. Основным источником энергии для эритроцитов является глюкоза, метаболизирующаяся по двум основным путям: путь Эмбдена-Мейергофа и в гексозомонофосфатный путь.

Лишенный глюкозы эритроцит деградирует, переходит в эхиноцит,

окислительного стресса.

Метаболизм глюкозы в пути Эмбдена-Мейергофа заканчивается образованием пирувата или лактата. Проникновение глюзозы в эритроцит происходит довольно быстро с помощью неиндентифицированного переносчика мембраны клеток. Концентрация глюкозы в эритроцитах такая же, как и в плазме крови. Основные стадии пути Эмбдена-Мейергофа включают: фосфорилирование глюкозы при участии АТФ и гексокиназы.

Образующийся в гексокиназной реакции глюкозо-6-фосфат участвует в 3-х направлениях метаболизма в эритроцитах с участием ферментов фосфоглюкокиназы, глюкозофосфоизомеразы (ГФИ) и глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ). В глюкозо-6-фосфатдегидрогеназных реакциях восстанавливается до НАДФ*Н. В 6-

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

22

фосфоглюконатдегидрогеназной реакции в эритроцитах образуется рибулозо-5-фосфат, который находится в равновесии с рибозо-5-фосфатом и ксилулозо-5-фосфатом.

Вфизиологических условиях энергетические потребности эритроцитов покрываются в результате утилизации глюкозы в пути Эмбдена-Мейергофа и гексозомонофостном пути. Однако эритроциты обладают способностью метаболизировать фруктозу, лактозу, галактозу, нуклеотиды, в частности инозин.

Вэритроцитах происходят реакции восстановления метгемоглобина. Как известно, в процессе диссоциации оксигемоглобина железо гемоглобина

приобретает 2-х валентное ферро-состояние. В ряде случаев О2 отрывается в виде супероксиданион-радикала, забирает один электрон у железа и превращает гемоглобин в метгемоглобин. В присутствии восстановленного глютатиона и аскорбиновой кислоты метгемоглобин восстанавливается до гемоглобина.

Гемоглобин эритроцитов. Основным белком эритроцитов, на долю которого приходится около 98% всей массы белков цитоплазмы, является гемоглобин. Последний является гетеродимерным тетрамером, состоящим из четырех полипептидных цепей, соединенных с четырьмя молекулами гема. В свою очередь гем – это молекула протопорфина IX, связанная с анионом железа. Каждый тетрамер гемоглобина может обратимо связывать и транспортировать не более 4-х молекул кислорода. К числу основных гемоглобинов (Hb) взрослого человека относится гемоглобин А (от слова adultus – взрослый), на долю которого приходится 96–98 % и в составе которого имеются две α- и две β-цепи (α2β2) (рисунок 2.1.).

Рисунок 2.1. – Строение гемоглобина

К числу нормальных гемоглобинов относится гемоглобин А2 , который содержится в крови взрослого человека в количестве 1,5-3,5 % (HbA2). На

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

23

долю фетального гемоглобина (HbF) приходится 0,5-1 %. Смена гемоглобина F на гемоглобин А происходит во время рождения ребенка, а к 4-6 месяцам жизни уровень фетального гемоглобина составляет 1 %.

Главным регулятором сродства Hb к О2 является промежуточный продукт гликолиза – 2-3-дифосфоглицериновая кислота (2-3-ДФГ). Увеличение образования 2-3-ДФГ снижает сродство Hb к О2, что приводит к сдвигу кривой диссоциации оксигемоглобина вправо и к усиленному поступлению О2 в ткани. Сдвиг кривой вправо возникает также при увеличении температуры тела, возрастании уровня СО2 или на фоне развития метаболического ацидоза.

Фетальный гемоглобин слабо связывается с 2-3-ДФГ и поэтому характеризуется более высокой кислородсвязывающей способностью по сравнению с HbA.

Гены гемоглобина: 2 гена α–цепей глобина расположены в 16-й паре хромосом, а 11 пара хромосом содержит пару генов γ-цепей и по одной копии δ- и β-цепей. Глобин синтезируется только в эритрокариоцитах и лишь в период созревания ретикулоцита из нормоцитов. На каждой стадии развития гены α-глобина и других глобинов координировано экспрессируются.

Избыточное образование одной цепи гемоглобина, происходящее при талассемии, приводит к преципитации белка в эритроците, повреждению клетки и её преждевременной элиминации клетками моноцитарномакрофагальной системы.

Биосинтез и деградация гема. Обмен железа. Гем, железосодержащее тетрагидропиррольное красящее вещество, является составной частью О2- связывающих белков и различных коферментов оксидоредуктаз. Почти на 85% биосинтез гема происходит в костном мозге и лишь небольшая часть – в печени. В синтезе гема участвуют митохондрии и цитоплазма.

Синтез тетрагидропиррольных колец начинается в митохондриях. Из сукцинил-КоА (см. рисунок 2.2., схема вверху), промежуточного продукта цитратного цикла, конденсацией с глицином получается продукт, декарбоксилирование которого приводит к 5-аминолевулинату (ALA). Отвечающая за эту стадию 5-аминолевулинат-синтаза (ALA-синтаза) является ключевым ферментом всего пути. Экспрессия синтеза ALA-синтазы тормозится гемом, т. е. конечным продуктом, и имеющимся ферментом. Это типичный случай торможения конечным продуктом, или ингибирования по типу обратной связи.

После синтеза 5-аминолевулинат переходит из митохондрий в цитоплазму, где две молекулы конденсируются в порфобилиноген, который уже содержит пиррольное кольцо. Порфобилиноген-синтаза ингибируется ионами свинца. Поэтому при острых отравлениях свинцом в крови и моче обнаруживают повышенные концентрации 5-аминолевулината.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

24

Рисунок 2.2. – Биосинтез гема

На последующих стадиях образуется характерная для порфирина тетрапиррольная структура. Связывание четырех молекул порфобилиногена с отщеплением NH2-групп и образованием уропорфириногена III катализируется гидроксиметилбилан-синтазой (3). Для образования этого

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

25

промежуточного продукта необходим второй фермент, уропорфириноген IIIсинтаза. Отсутствие этого фермента приводит к образованию «неправильного» изомера – уропорфириногена I.

Тетрапиррольная структура уропорфиринoгена III все еще существенно отличается от гема. Так, отсутствует центральный атом железа, а кольцо содержит только 8 вместо 11 двойных связей. Кроме того, кольца несут только заряженные боковые цепи радикалов (R) (4 ацетатных и 4 пропионатных остатков). Так как группы гема в белках функционируют в неполярном окружении, необходимо, чтобы полярные боковые цепи превратились в менее полярные. Вначале четыре ацетатных остатка (R1) декарбоксилируются с образованием метильных групп (5 стадия). Образующийся копропорфириноген III снова возвращается в митохондрии. Дальнейшие стадии катализируются ферментами, которые локализованы на/или внутри митохондриальной мембраны. Прежде всего под действием оксидазы две пропионатные группы (R2) превращаются в винильные (6 стадия). Модификация боковых цепей заканчивается образованием

протопорфириногена IX.

На следующей стадии за счет окисления в молекуле создается сопряженная π-электронная система, которая придает гему характерную красную окраску. При этом расходуется 6 восстановительных эквивалентов (7 стадия). В заключение с помощью специального фермента, феррохелатазы, в молекулу включается атом двухвалентного железа (8 стадия). Образованный таким образом гем или Fe-протопорфирин IX включается, например, в гемоглобин и миоглобин, где он связан нековалентно, или в цитохром С, с которым связывается ковалентно.

Известен ряд заболеваний, вызванных наследственными или приобретенными нарушениями порфиринового синтеза, так называемые порфирии; некоторые из них протекают очень тяжело. Многие из этих заболеваний приводят к выделению предшественников гема с калом или мочой, которая вследствие этого может быть окрашена в темно-красный цвет. Также наблюдается отложение порфиринов в коже. При воздействии света это приводит к образованию трудноизлечимых волдырей. При порфириях часты также неврологические нарушения. Возможно, что в основе средневековых легенд о людях-вампирах (дракулах) лежит странное поведение больных порфириями (светобоязнь, необычные внешность и поведение, употребление крови в пищу, компенсирующее дефицит гема и зачастую улучшающее состояние при некоторых формах порфирий).

В организме человека в течение 1 ч разрушается примерно 100-200 млн эритроцитов. Разрушение начинается в микросомальной фракции ретикулоэндотелиальной системы (RES)клеток печени, селезенки и костного мозга. После отделения белковой части (глобина) красный гем расщепляется гемоксигеназой с помощью кислорода и НАДФН на ионы Fe2+, СО (монооксид углерода) и зеленый биливердин. Далее железо утилизируется.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

26

Затем биливердин восстанавливается биливердинредуктазой до оранжевого билирубина. Это изменение цвета легко можно наблюдать in vivo в виде синяков (гематомах). Интенсивный цвет гема и других порфиринов является результатом сопряжения многочисленных двойных связей, которые образуют две резонансно стабилизированные (мезомерные) системы.

Для дальнейшего разрушения билирубин транспортируется кровью в печень. Так как он плохо растворим в плазме, транспорт осуществляется в комплексе с альбумином. В том же участке связывания альбумина сорбируются и лекарственные препараты. Паренхиматозные клетки печени забирают билирубин из крови.

После того как билирубин в печени дважды конъюгируется с активированной глюкуроновой кислотой (УДФ-GIcUA), повышается его водорастворимость. Образование конъюгата катализируется УДФглюкуронозилтрансферазой – ферментом, находящимся в эндоплазматическом ретикулуме печени, а также в незначительных количествах в почках и слизистой кишечника. Глюкуроновая кислота присоединяется к пропионатным боковым цепям билирубина сложноэфирными связями. Образующийся диглюкуронид билирубина переносится в желчь путем активного транспорта против градиента концентрации. Этот транспорт является скорость-лимитирующей стадией метаболической трансформации билирубина в печени. Лекарственные препараты, такие, как, например фенобарбитал, могут индуцировать образование конъюгата и транспортный процесс.

В кишечнике конъюгат билирубина снова частично расщепляется бактериальной β-глюкуронидазой. Свободный билирубин постепенно восстанавливается до бесцветного уробилиногена и стеркобилиногена, которые далее окисляются кислородом воздуха до уробилина и стеркобилина. Эти конечные продукты метаболической трансформации желчных пигментов в кишечнике окрашены в цвета от оранжевого до желтого. Они выделяются по большей части с калом, а в меньшей степени резорбируются. При интенсивном процессе разрушения гема в моче внезапно появляется уробилиноген, где он при окислении кислородом воздуха темнеет, превращаясь в уробилин. Схема деградации гемоглобина представлена на рисунке 2.3.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

27

Рисунок 2.3. – Деградация гемоглобина и гема

Наряду с гемоглобином, по аналогичному пути разрушаются группы гема и у других гемсодержащих белков (миоглобина, цитохрома, каталазы, пероксидазы). Однако их вклад в образование желчных пигментов (250 мг в сутки) составляет лишь примерно 10-15%.

Всасывание железа происходит в кишечнике и является лимитированным процессом. Считается, что всасывается 1/10 часть железа

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

28

пищевых продуктов. В пищевых продуктах содержится окисленное трёхвалентное железо, которое в кислой среде желудка переходит в Fе2+. Всасывание железа происходит в несколько этапов: поступление в энтероциты при участии муцина слизистой оболочки, внутриклеточный транспорт ферментами энтероцитов, переход железа в плазму крови. Во всасывании железа участвует белок апоферритин, который связывает железо и накапливается в слизистой кишечника, создавая депо железа. Эта стадия обмена железа является регуляторной: синтез апоферритина уменьшается при недостатке железа в организме.

Всосавшееся железо транспортируется в составе белка трансферрина, где окисляется церулоплазмином до Fе3+, в результате чего возрастает растворимость железа. Трансферрин взаимодействует с тканевыми рецепторами, количество которых очень вариабельно. Этот этап обмена также является регуляторным.

Железо может депонироваться в форме ферритина и гемосидерина. Ферритин печени – водорастворимый белок, содержащий до 20% Fе2+ в виде фосфата или гидроксида. Гемосидерин – нерастворимый белок, содержит до 30% Fе3+,включает в свой состав полисахариды, нуклеотиды, липиды.

Выведение железа из организма происходит в составе слущивающегося эпителия кожи, кишечника. Незначительное количество железа теряется через почки с жёлчью и слюной.

5. Дыхательная функция крови.

Дыхательная функция крови сводится главным образом к транспорту газов гемоглобином. Главная функция эритроцитов – транспорт кислорода от легких в ткани и СО2 от тканей обратно в легкие. Высшие организмы нуждаются для этого в специальной транспортной системе, так как молекулярный кислород плохо растворим в воде: в 1 л плазмы крови растворимо только около 3,2 мл О2. Содержащийся в эритроцитах белок гемоглобин (Hb) способен связать в 70 раз больше – 220 мл О2/л. Содержание Hb в крови составляет 140-180 г/л у мужчин и 120-160 г/л у женщин, т. е. вдвое выше по сравнению с белками плазмы (50-80 г/л). Поэтому Hb вносит наибольший вклад в образование рН-буферной емкости крови.

Методом рентгеноструктурного анализа было показано наличие двух основных конформаций гемоглобина, называемых R- и Т-состояниями. Кислород связывается с гемоглобином, находящимся в любом состоянии, но гораздо большее сродство он все же имеет к гемоглобину в состоянии R. Связывание с кислородом стабилизирует R-состояние. Экспериментально показано, что в отсутствие кислорода более устойчивым является состояние Т и преобладает конформация дезоксигемоглобина (без кислорода). Буквы Т и R исходно обозначали соответственно напряженную (англ, tense) и релаксированную (англ. relaxed) конформацию, поскольку состояние Т стабилизировано большим количеством ионных пар, многие из которых расположены в зоне контакта α1β2 (и α2β1). Связывание кислорода с

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

29

субъединицей гемоглобина, находящейся в состоянии Т, приводит к конформационным изменениям и переходу в состояние R. В результате изменения конформации всего белка структура отдельных субъединиц изменяется слабо, однако пары αβ-субъединиц скользят одна по другой и поворачиваются, так что расстояние между β-субъединицами уменьшается. При этом разрушаются некоторые ионные пары, стабилизирующие состояние Т и образуются новые.

Гемоглобин должен эффективно связывать кислород в легких, где парциальное давление кислорода (рO2) составляет приблизительно 13,3 кПа, и высвобождать его в тканях, где рO2 примерно равно 4 кПа. В случае гемоглобина эта проблема решается путем перехода из низкоаффинного состояния (состояния Т) в высокоаффинное (состояние R) по мере связывания молекул O2. В результате кривая связывания гемоглобина с кислородом имеет S-образный (сигмовидный) характер (рисунок 2.4).

Рисунок 2.4 – Кривая связывания кислорода гемоглобином

Белок, состоящий из одной субъединицы с одним центром связывания лиганда, не может иметь S-образную кривую связывания, даже при условии, что это связывание сопровождается конформационными изменениями, поскольку каждая молекула лиганда связывается независимо и не может влиять на взаимодействие с другими молекулами. Напротив, присоединение O2 к одной субъединице гемоглобина изменяет сродство к кислороду других субъединиц. Первая молекула O2, взаимодействующая с дезоксигемоглобином, связывается слабо, поскольку субъединица находится в состоянии Т. Но это взаимодействие приводит к конформационным изменениям, затрагивающим соседние субъединицы, в результате чего облегчается присоединение следующих молекул O2. Действительно, переход Т → R во второй субъединице осуществляется быстрее, если в первой

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ

30

субъединице произошло связывание O2. Последняя (четвертая) молекула кислорода связывается с гемом в субъединице, уже находящейся в состоянии R, и поэтому сродство гемоглобина к четвертой молекуле кислорода гораздо выше, чем к первой.

Подобно миоглобину, гемоглобин может связывать не только кислород, но и другие газы. Важным примером является связывание монооксида углерода (угарного газа), который связывается с гемоглобином примерно в 250 раз лучше, чем кислород. Вдыхание СО может вызвать очень тяжелые последствия для здоровья человека.

Гемоглобин не только переносит от легких к тканям практически весь кислород, необходимый клеткам, но он также переносит образующиеся при дыхании клеток Н+ и СO2 от тканей в легкие и почки, где они выводятся из организма. Газообразный СO2, образующийся при окислении органических молекул в митохондриях, вступает в реакцию с водой и образует бикарбонат:

СO2 + Н2O Н+ + НСO3–

Данную реакцию катализирует карбоангидраза, которой особенно много в эритроцитах. Диоксид углерода не очень хорошо растворяется воде, и если бы он не превращался в бикарбонат, то образовывал бы пузырьки в крови и тканях. Как видно из уравнения реакции, гидратации СО2 приводит к повышению концентрации (снижению pH) в тканях. Связывание кислорода с гемоглобином очень сильно зависит от pH и концентрации СО2, так что взаимные превращения СО2 и бикарбоната играют важнейшую роль в регуляции связывания и высвобождения кислорода в крови.

Гемоглобин переносит около 40% Н+ и 15-20% СО2, образующихся в тканях, к легким и почкам (остаток Н+ поглощается бикарбонатным буфером плазмы крови, а остаток СО2 переносится в виде растворенных НСО3– и СО2). Связывание Н+ и СО2 обратно пропорционально связыванию кислорода. При относительно низком значении pH и высокой концентрации СО2 в периферических тканях сродство гемоглобина к кислороду снижается по мере связывания Н+ и СО2, и кислород высвобождается. И наоборот, в капиллярах легких по мере выделения СО2 и повышения pH крови сродство гемоглобина к кислороду возрастает, и белок может связывать большее количество О2 для доставки к периферическим тканям. Это влияние pH и концентрации СО2 на связывание и высвобождение кислорода гемоглобином называют эффектом Бора по имени датского физиолога Кристиана Бора (отца физика Нильса Бора), открывшего этот эффект в 1904 г.

Равновесная реакция связывания гемоглобина с одной молекулой кислорода выглядит следующим образом;

Нb + O2 НbO2

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ БИОХИМИЯ