2. Структурно-функциональная организация хромосом план

1. Строение хромосом.

2. Упаковка ДНК в разных ядерных структурах, в том числе в хромосомах.

3. Кариотип и идиограмма.

1. Строение хромосом

Морфология хромосом обычно описывается на стадии метафазы или анафазы, когда они лучше всего видны в клетке. Есть растения, морфологию хромосом которых можно описать в профазе мейоза или митоза.

Один из критериев классификации хромосом – расположение центромеры (рисунок 1). Различают:

• акроцентрические (палочкообразные). Хромосомы, центромера которых находится на конце или второе плечо настолько мало, что оно неразличимо на цитологических препаратах;

• субметацентрические. Хромосомы с разнящимися по длине плечами;

• метацентрические. У таких хромосом центромера расположена посередине или с некоторым отклонением от нее.

Рисунок 1 – Типы метафазных хромосом в зависимости от положения центромеры

Объективный критерий, позволяющий отнести хромосому к той или иной группе, – центромерный признак, – отношение длины короткого плеча к длине хромосомы в процентах:

• акроцентрические – до 12,5%;

• субметацентрические – 12,6-37%;

• метоцентрические – 37,1-50%.

Центромеру также называют первичной перетяжкой. Она определяет движение хромосомы и различима в виде более светлой зоны, которая движется в митозе и увлекает за собой несколько отстающие плечи хромосомы. Центромера имеет сложное строение: в ней находится ДНК с характерной последовательностью нуклеотидов, ассоциированная со специальными белками.

На хромосоме, как правило, имеется одна центромера, потеря которой может привести к нарушению подвижности и потере хромосомы, – следствие хромосомной аберрации, вызванной ионизирующим излучением.

Есть виды, содержащие полицентрические хромосомы с так называемой диффузной центромерой:

• растение рода Lusula (ожика);

• животные Ascaris megalocephala;

• насекомые отряда Hemiptera и другие.

На хромосомах имеются и вторичные перетяжки, которые не являются местом прикрепления нитей веретена деления, и они не определяют угла изгиба хромосом при их движении. Вторичные перетяжки также называются ядрышковыми организаторами. В них локализуются гены, отвечающие за синтез рРНК.

Теломеры в значительной степени ответственны за существование хромосом как индивидуальных образований и препятствуют их слипанию.

Структура хромосом, видимых в световой микроскоп, представлена:

• темными участками или гетерохроматином;

• светлыми участками или эухроматином.

В гетерохроматине в сравнении с эухроматином спирализация хромосом очевиднее. При этом активность гетерохроматиновых участков меньше таковой эухроматиновых участков. Особенности распределения эу- и гетерохроматиновых участков постоянны для каждой хромосомы на определенной стадии митоза.

Спутники – участки, соединяющиеся с хромосомой посредством тонкой нити хроматина. Форма и величина спутника постоянны для хромосом.

Дифференциальная окраска хромосом. Один из способов выявления дифференцировки хромосомы по длине – окраска красителями, имеющими сродство к участкам ДНК определенного строения.

Даже окраска по Фельгену, которая специфична относительно дезоксирибозы ДНК, при использовании некоторых предобработок позволяет выявлять участки хромосом, окрашивающиеся с разной интенсивностью.

При Q- и Н-окраске используются флуоресцирующие красители – квинакрин (quinacrine) и Hoechst 33258, соответственно. Они позволяют выявлять участки хромосом, обогащенные парами нуклеотидов А-Т.

G-окраска выявляет участки, обедненные генами, содержащие повышенное по сравнению со среднестатистическим количество А и Т. У человека в этих участках часто локализуются повторяющиеся последовательности LINE.

R-окраска основана на использовании специальной предварительной обработке с последующей окраской красителем Гимза. Применяется для выявления поперечной исчерченности хромосом, обратной той, которая выявляется G-окраской. Участки R обогащены генами, которые содержат повышенное число пар Г–Ц, в них (у человека) часто встречаются повторяющиеся элементы SINE.

Т-окраска – вариант R-окраски, предназначенный для выявления преимущественно концевых (теломерных) участков, наиболее обогащенных генами, парами Г–Ц и элементами SINE.

С-окраска, основана на тепловой денатурации и последующей ренатурации ДНК и окраской по Гимза. Это инструмент выявления преимущественно гетерохроматиновых участков хромосом.

FISH (fluorescent in situ hybridization) – дает возможность выявлять участки гомологии какому-либо фрагменту предварительно денатурированных молекул ДНК, объединенному с флуоресцирующим красителем, используемому в качестве зонда при гибридизации, непосредственно на цитологических препаратах.

GISH (genomic in situ hybridization) – аналог метода FISH, но использующий в качестве зонда полную геномную ДНК какого-либо вида. Позволяет выявлять участки гомологии на препаратах хромосом другого вида.

Два последних метода не относятся к методам дифференциальной окраски в строгом смысле слова, но они также делают возможным выявление гетерогенности хромосом по длине.

Дополнительные возможности для выявления структурно-функциональной дифференциации хромосом по длине открывают методы иммунодетекции белков, взаимодействующих с ДНК хромосом постоянно или только на определенных стадиях клеточного цикла. Флуоресцентная микроскопия, компьютерные обработки изображений позволяют создавать многоцветные, эффектные образы хромосом.

Хромомерная организация хромосом. Хромосомная нить на стадии профазы митоза содержит небольшие сильно окрашивающиеся тельца, называемые хромомерами.

Наиболее выраженными являются хромомеры, встречающиеся в политенных хромосомах и хромосомах типа «ламповых щеток».

Виды известных хромомер:

• лептотенные;

• пахитенные;

• хромосом типа «ламповых щеток»;

• интерфазных политенных хромосом.

Общие свойства хромомер:

1. Представляют собой отрезки компактизованной ДНК.

2. Число и рисунок хромомер у данного организма постоянны на данной стадии клеточного цикла.

Число хромомеров существенно варьирует в разных типах тканей. Пример: пахитенные хромосомы Ornithogalum virens содержат 274 хромомеров, а в профазе митоза в клетках пыльцы их насчитывается 67. Причина такого различия связана с тем, что хромосомы клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, имеют разную степень компактизации.

Изменение числа хромомеров сопровождается изменением их генетического содержания.

Результаты исследований Дж. Беллинга, Лима-де-Фариа, X. Кэллана, Х. Бауера и других ученых позволяют сделать вывод, что хромомеры – это фрагменты хромосом, способные к локальной компактизации. Длина фрагмента ДНК, входящего в состав хромомера, различна на разных этапах процесса компактизации хромосом в ходе клеточного цикла. Поэтому закономерно предположить, что хромомер не может быть постоянной структурной единицей генома и для каждого этапа онтогенеза существуют свои наборы хромомеров.

Гигантские (политенные) хромосомы. Длина этих хромосом больше таковой у хромосом многих интерфазных клеток в 100-200 раз, толщина – в 1000 раз.

Первое доказательство существования гигантских хромосом получено в 1881 г. Е. Бальбиани, который обнаружил их в клетках слюнных желез мотыля (Chironomus).

У личинок Drosophila melanogaster общая длина четырех пар хромосом в слюнных железах равна 2000 мкм, а в соматических клетках аналогичная величина составляет 7,5 мкм.

Причины характерных форм и размеров гигантских хромосом:

• максимальная деспирализация;

• многократное воспроизведение хромосом без последующего расхождения.

Участки более плотной спирализации хромонем (хромомеры) на гигантских хромосомах представлены в форме поперечной исчерченности – дисков. Такие политенные хромосомы далее не воспроизводятся и находятся в состоянии соматической конъюгации гомологов, достигающей идеальной точности.

Диски и междисковые участки гомологов расположены строго параллельно и на большом протяжении хромосом тесно сближены. Такая конъюгация не характерна для хромосом подавляющего большинства соматических клеток. Возможность четко различать детали строения гигантских хромосом в дальнейшем была использована Т. Пайнтером для изучения их перестроек и характера конъюгации хромосом.

Хромосомы типа «ламповых щеток» открыты В. Флеммингом в 1878 г. Хромосомы этого типа являются результатом длительного мейотического деления, продолжительность которого может составлять несколько месяцев. В течение этого времени хромосомы пребывают в сильно декомпактизованном состоянии и их можно наблюдать в световой микроскоп. На более поздних стадиях мейоза хромосомы становятся компактными.

Флемминг со своим студентом, изучая развитие ооцитов у амфибий и рыб, столкнулись со «странными тонкими структурами» в окрашенных срезах ядер ооцитов аксолотля Siredon pisciformis, находящихся на ранних стадиях развития. Рисунок этих хромосом был опубликован в 1882 г. На нем были изображены ядра, содержащие толстые осевые тяжи, с отходившими от них тонкими радиальными нитями.

У. Дюрие в 1941 г. показал, что в состав этой хромосомы входит длинная нить, с расположенными на ней парными гранулами (хромомерами) размером 1-2 мкм, от которых отходят петли (рисунок 2).

Рисунок 2 – Схема строения бивалента типа «ламповых щеток», представленная Дюрие

В наше время большие успехи в исследованиях хромосом этого типа достигнуты Дж. Голлом и X. Кэлланом. Благодаря им стало известно, что хромомеры различных размеров регулярно опознаются в одних и тех же положениях в хромосоме от препарата к препарату. Именно хромомеры и нити между ними содержат ДНК.

Благодаря наличию петель с сильно различающейся морфологией стала доступной быстрая идентификация хромосомы в целом, так и отдельного ее участка, что соответственно, упростило картирование хромосом данного типа.

Петли хромосом типа «ламповых щеток» по характеру накопления материала часто сильно разнятся (рисунок 3).

Рисунок 3 – Некоторые характерные типы петель и связанных с ними хромомеров в хромосомах типа «ламповых щеток»

Все хромосомы типа «ламповых щеток» состоят из пары хроматид, что можно наблюдать при механическом растяжении хромосомы с помощью микроманипулятора. Такой подход к изучению структурной организации хромосом показал, что материал петли выходит из одного хромомера и входит в соседний, а затем эти хромомеры сливаются в один в нерастянутой хромосоме. То есть петля – это межхромомерный промежуток хромосомы, а пара петель, выходящих из одной и той же пары хромомеров, – это две хроматиды.

Каждая петля отличается довольно сложным строением – состоит из нитевидной сердцевины, окруженной накопленными в данном районе продуктами активности. От начала до конца петли накопление продуктов происходит асимметрично.

Классическое распределение матрикса – по длине всей петли. При этом ясно различаются толстый и тонкий концы петли, толщина матрикса постепенно нарастает от тонкого конца к толстому и, достигнув максимума, больше не увеличивается. Производное этого типа организации: транскрипционная единица в петле расположена также полярно, однако в ее начале и конце имеются нетранскрибируемые участки. Есть петли, включающие две или более транскрипционные единицы противоположной полярности, расположенные либо «голова к голове» (голова – точка начала транскрипции), либо «хвост к хвосту» (хвост – участок терминации транскрипции).

Возможности использования хромосом типа «ламповых щеток» значительно увеличились благодаря результатам исследований, полученным в 1998 г. Дж. Голлом и К. Морфи. Ими установлена возможность искусственного индуцирования «ламповых щеток», например, посредством инъецирования головки спермия в ооцит, в котором изначально имелись хромосомы этого типа. В этом случае из ДНК спермия формируются хромосомы типа «ламповых щеток», число которых идентично числу хромосом гаплоидного набора вида. Не исключено, что такие хромосомы в скором будущем начнут получать после инъекций спермиев млекопитающих, и в первую очередь человека, что позволит картировать хромосомы с высоким уровнем разрешения.