3. Центровая теория гена
Импульсом к дальнейшему развитию теории гена послужили противоречия, наблюдаемые при последовательном строгом применении критериев аллелизма в экспериментах школы А.С. Серебровского с дрозофилой в 20-30 гг.
А.С. Серебровский и его молодые сотрудники доказали протяженность и сложную структуру гена в работах по исследованию так назывемого ступенчатого аллеломорфизма. Явление это было открыто при изучении локуса sc- ас (scute- achaete), который контролирует развитие щетинок у D. melanogaster. Его мутации приводят к редукции щетинок, а также к некоторым дополнительным фенотипическим эффектам. Разные мутантные аллели приводят к различающимся изменениям фенотипа.
Оказалось, что независимо возникшие мутации в локусе sc-ас, полученные под действием У-лучей, вступают в сложные отношения аллелизма. Две аллели могут иметь как сходство, так и различия в фенотипическом проявлении: в редукции определенных щетинок. При объединении независимо возникших мутантных аллелей в компаунде обычно редуцировались лишь те щетинки, которые были утрачены у обоих родителей. При графическом изображении взаимодействия нескольких пар аллеломорфов в компаундах получалось нечто вроде лестницы, ступенями которой служили отдельные аллели. Это явление и получило наименование ступенчатого аллеломорфизма.
На основе исследования ступенчатого аллеломорфизма удалось построить линейный план гена sc-ас. Кроме того, Н.П. Дубининым был сделан вывод о том, что ген sc–ас состоит из более мелких элементов – центров. Предполагалось, что в случае мутирования изменяется не весь ген, а лишь некоторые его центры.
Так, с помощью генетического анализа мутаций scute путем использования классических тестов на аллелизм Серебровский с сотрудниками получили результаты, позволившие им выдвинуть гипотезу о существовании функциональных единиц меньшего, чем ген, порядка – трансгенов. Они предполагали, что трансгены располагаются внутри гена в линейном порядке и что развитие признака обусловливается их функциональным взаимодействием. В результате была сформулирована так называемая центровая теория гена, согласно которой основной ген (Серебровский предложил называть его базигеном) подразделяется на несколько функционально самостоятельных субгенов (трансгенов).
4. Псевдоаллелизм
С начала 40-х гг. нашего века начали публиковаться работы по проблеме так называемого «псевдоаллелизма». В них развиваются представления о сложной структуре гена. В работах К. Оливера, М. Грина, Е. Льюиса с D. melanogaster были получены примеры рекомбинаций мутаций, которые в соответствии с функциональным тестом должны были считаться аллельными. Это противоречие между рекомбинационным и функциональным критериями аллелизма и породило термин «псевдоаллелизм».
Открытие Серебровского получило подтверждение спустя почти 20 лет, после того как выяснилось, что ген может быть разделен путем кроссинговера. Эти сведения были получены в 40-х гг. американскими учеными К. Грином, М. Грином, К. Оливером и Е. Льюисом при изучении рецессивных мутантных аллелей гена lozenge.
Изучая у дрозофилы действие двух аллелей гена lozenge, К. Грин и М. Грин установили, что мутации lz50е и lz8 в гомозиготе и в компаунде (гетероаллельная комбинация) с другими мутациями lz дают ярко выраженный мутантный фенотип, а в компаунде lz50e / lz8 – частично комплементарны и дают фенотип, близкий к нормальному.
Оливер обнаружил также, что в потомстве, получаемом от анализирующего скрещивания гетерозиготы lz s/ lzg, с постоянной частотой возникают реверсии (возврат) к дикому типу, которые, по его мнению, можно объяснить рекомбинацией между сцепленными с локусом lozenge аллелями. Аналогичный эффект получил и Льюис при рекомбинационном анализе, произведенном с двумя аллелями другого гена, также определяющего развитие глаз у дрозофилы. Предположив, что отдельные участки гена способны к рекомбинации, Льюис сделал следующее допущение: мутация захватывает не весь ген, а лишь небольшую его часть, между частями гена происходит кроссинговер. Мутации одного гена, т.е. аллельные мутации, между которыми происходит кроссинговер, получили название псевдоаллели. В тех случаях, когда наблюдаются противоречия между функциональной и рекомбинационной оценками мутации на аллелизм, используется термин «псевдоаллелизм».
Число примеров «псевдоаллелизма» (рекомбинации между мутациями, аллельными на основании функционального теста) быстро возрастало, особенно с развитием генетики микроорганизмов. Стало ясно, что «псевдоаллелизм» – правило, а не исключение.
5. Цис-транс-тест на аллелизм
Исходя из того, что ген представляет собой сложную в функциональном и рекомбинационном отношениях единицу наследственности, для определения аллельности мутаций у дрозофилы Льюис предложил тест на комплементарность, так называемый цис-транс-тест.
Согласно этому тесту мутации попарно испытывают в гетерозиготе в двух конфигурациях: цис – обе мутации в гибриде происходят от одного родителя, и транс – они поступают в гибрид от разных родителей.
Сущность его сводится к тому, что при цис-положении обе мутации гибрид получает от одного родителя, при транс-положении – от обоих. Наиболее существенную роль играет транс-тест, а цис-тест является как бы его контролем. Транс-тест по сути аналогичен функциональному тесту на аллелизм, предложенному Морганом. Принципиальные же различия между ними состоят в том, что Морган считал ген неделимой структурной единицей хромосомы, а Льюис исходил из того, что ген представляет собой сложную систему, состоящую из нескольких самостоятельных в фенотипическом выражении функциональных единиц. Цис-транс-тест, таким образом, позволяет установить, аллельны или неаллельны мутации даже в том случае, если они локализуются в одном гене, но принадлежат разным функциональным единицам.
В цис-типе наблюдается полное доминирование нормальных аллелей и оба рециссивных мутантных аллеля не проявляются. В другом генетическом изомере, названном транс-типом, мутантные псевдоаллели находятся в разных хромосомах (а+/+b).
В этом случае обнаруживается псевдоаллелизм и рецессивные признаки проявляются.
Грин изучил 19 независимых мутаций, давших развитие признака lozenge. Они оказались связанными с изменениями в трех рядом расположенных локусах. Между этими локусами с ничтожной частотой происходил перекрест (0,09 и 0,06%). Взаиморасположение этих локусов, каждый из которых имеет свою серию аллелей, имеет вид:
Путем перекреста были получены хромосомы с разным взаимоположением мутантных аллелей трех локусов. Цис-типы во всех случаях обнаруживали нормальные признаки, а транс-типы – проявление рецессивов:
У всех транс-типов, при которых псевдоаллели расположены в разных хромосомах, развивается фенотип рецессивных мутантов. С другой стороны, для всех цис-типов, при которых мутантные псевдоаллели расположены в одной хромосоме, характерна полная рецессивность мутаций, у них развивается нормальный фенотип.
Исходя из представления о связанности функций псевдоаллелей, было предложено объяснить это загадочное влияние положения аллелей в разных генетических изомерах изменением цепи последовательных биохимических реакций. Это объяснение было предложил Понтекорво, использовавший теоретические положения о микромолярных реакциях, разработанные Мак-Илфайном. Люис также высказал, а затем детально разработал эти гипотезы.
В основу этого положена идея о том, что последовательность нормальных аллелей данной группы в хромосоме не имеет случайного характера, она отражает последовательность прохождения ряда биохимических реакций, в которых отдельный локус хромосомы определяет одно звено. Если мы имеем два псевдоаллеля (a+b+), то протекание цепи реакций будет иметь такой вид: действие первого псевдоаллеля (а+) служит причиной появления вещества А за счет реакции, которая преобразует какой-то исходный субстрат (С) в это вещество (реакция С→А). Второй псевдоаллель (b+) преобразует вещество А в вещество В (реакция А→В). В случае наличия большого числа рядом расположенных псевдоаллелей реакция приведет к появлению веществ D, Е и т.д. Условием для нормального протекания этой цепи реакций является близость внутри хромосомы нормальных аллелей и их порядок, обепечивающий последовательность звеньев в цепи реакций. Вполне понятно, что мутация любого из нормальных локусов будет прерывать или нарушать течение реакций в соответствующих звеньях.
В свете этих представлений понятны различия функций генов в транс- и цис-типах. В случае цис-типа наличие двух нормальных аллелей в одной хромосоме ведет к нормальному появлению сначала вещества А, а затем вещества В. При транс-расположении в одной хромосоме имеется мутация одного псевдоаллеля (а), а в другой – другого (b). В одной хромосоме наличие мутации (а) ведет к образованию недостаточного количества вещества А, вследствие чего не образуется достаточного количества вещества В. В другой – наличие мутантного аллеля (b) не дает нормальной реакции А→В, вследствие чего также не образуется достаточного количества вещества В (<В). В результате характер взаимоположения псевдоаллелей в паре гомологичных хромосом определяет их функции, что показано на схеме:
Наличие цепи последовательных реакций представляется очень вероятным в свете данных ряда работ и особенно исследований Люиса по псевдоаллелям биторакс у дрозофилы, которые вызывают преобразование груди (торакса) у имаго. Известны спонтанные мутации в трех рядом расположенных псевдоаллеля: биторакс (bx3), ультрабиторакс (ubx+) и битораксоид (bxd+). цепь реакций: box+→ubx+→bxd+. Это представление было подтверждено данными по хромосомным перестройкам. Так, разрывы, которые отделяют box+, bud+, bad не изменили действия аллелей bx+ и ubx+, но вели к появлению крайнего проявления признаков bxd. Причиной этого был разрыв цепи реакций, так как удаление нормального аллеля bxd+ от соседнего локуса ubx+ не позволило завершиться последнему звену в цепи реакций.
На основании этих, а также ряда других опытов Люис высказал предположение, что действие трех псевдоаллелей биторакс связана с наличием трех веществ А, В и D, действие которых зависит от их концентрации. Последовательность реакций, начинающихся с использования исходного субстрата (С), имеет такой вид:
Cbx+ Aubx+ Bbxd+ D
Таким образом, влияние нормального аллеля биторакс (bx+) приводит к превращению субстрата С в вещество А, нормального аллеля ультрабиторакс (ubx+) вызывает реакцию А→В и нормального аллеля битораксоид (bxd+) – реакцию: В→О.
Изучение перекреста позволило локализовать эти три локуса в таком порядке:
Аллели бито ракс (box, box3, bx34l) рецессивны, они в разной степени вызывают изменения метаторакса, переводя его на уровень мезоторакса, в результате чего галтеры превращаются в образования, похожие на крылья, развитие которых характерно для структур мезоторакса. Аллели битораксоид (bxd, bxd100) также рецессивны, они вызывают сходные изменения метаторакса, и, кроме того, первый абдоминальный сегмент изменяется до уровня развития метаторакса, в результате на этом брюшном сегменте может развиваться пара ног (выросты метаторакса). Такие особи вместо шести имеют восемь ног. Аллель ультрабиторакс (ubx)доминантный, у гетерозигот он вызывает небольшое увеличение галтеров, в гомозиготах летален.
Люис следующим образом объяснил разное проявление признаков в основных комбинациях трех псевдоаллелей биторакс:
В первом случае проявление мутации связано только с изменением галтеров, причина этого – заметное уменьшение количества вещества В. В этом генотипе одна хромосома содержит нормальные аллели, в результате все три вещества (ABD) появляются в нормальном количестве. Однако заметное уменьшение вещества в другой хромосоме создает некоторую его недостаточность в целом. Во втором случае хотя состав генов тот же, однако налицо проявление рецессивной мутации биторакс, так как блокировка реакций имеет место в обеих хромосомах. Эта блокировка уменьшает количество вещества В, так как в одной хромосоме имеется резкое уменьшение количества этого вещества (<<В) в силу действия мутации bx, в другой – среднее уменьшение его количества (<В) из-за действия мутации bx34l. Признаки битораксоида здесь не проявляются, так как количество вещества D (<<D и <D) снижено еще недостаточно. В особях третьего генотипа проявляются признаки рецессивной мутации битораксоид, так как уменьшение количества вещества D достигает соответствующего уровня (<<D <<D). У этих особей количество вещества В находится на таком уровне, когда признаки мутации биторакс еще не проявляются (В и <<В). У особей четвертого генотипа благодаря снижению ниже порога нормы как вещества В (<В и <<В), так и вещества D (<<D и <<D) появляются комбинации признаков двух рецессивных мутаций — биторакс и битораксоид.
Объяснение различий между цис- и транс-типами сделано на основании того, что вещества А, В и D не диффундируют в заметных количествах из данной хромосомы к гомологичной хромосоме. В противном случае генетическая изомерия не оказывала бы своего влияния. Однако в некоторых случаях диффузия все же имеет место. Этот факт установлен Люисом в его работе по новому типу эффекта положения. Люис показал, что большинство хромосомных перестроек, у которых хотя бы один разрыв прошел в любом месте между локусом биторакс и центромерой, т. е. на огромном участке хромосомы, содержащем более 500 дисков, вызывают эффект положения в транс-типе и не изменяют действие генов в цис-типе. Известно, что хромосомные перестройки нарушают конъюгацию гомологов. У дрозофилы благодаря тесному сближению гомологов при соматической конъюгации создается возможность проникновения вещества из одного в другой. Если это имеет место, тогда нарушение конъюгации, ведущее к пространственному разобщению нормальных аллелей, локализованных в транс-типе в разных хромосомах, должно приводить к нарастанию проявления мутационных признаков. Это и было показано в экспериментах Луиса.
Слабые аллели бито ракс и битораксоид (bх и bxd) не проявляют псевдоаллелизма в транс-структурах. В этих случаях имеет место обычная картина рецессивности мутаций вне зависимости от их расположения в гомологичных хромосомах. В этом случае имеем:
Лишь в случае использования сильных аллелей (bx3, bx34l, bxd100) имеет место псевдоаллелизм, как это было показано выше.
Отсутствие эффекта положения в транс-типах у слабых аллелей биторакс и битораксоид свидетельствует, что в этих случаях взаимодействие между гомологами таково, что диффузия веществ обеспечивает перенос достаточного количества предшественников, чтобы обеспечить цепь реакций, ведущих к нормальному развитию.