4.2 Репарация днк план
1. Основные типы репарации ДНК.
2. Рестрикция-модификация ДНК.
1. Основные типы репарации днк
Репарация – процесс исправления ошибок в последовательности нуклеотидов ДНК и восстановления ее исходной структуры.
Механизм исправления ошибок включает в себя большое число ферментативных реакций. Молекула ДНК является единственной среди всех макромолекул, которая не деградирует, а исправляет возникающие повреждения. Репарация сохраняет первичную структуру и генетическую информацию ДНК, обеспечивает ее высокую стабильность и поддержание целостности клеточного генома. В результате из 1000 случайных изменений ДНК в мутацию может реализоваться статистически менее одного случая.
Различают несколько видов репарации:
фотореактивация;
эксцизионная репарация;
рекомбинационная (пострепликативная) репликация;
SOS-репарация.
Фотореактивация – восстановление исходной структуры молекулы ДНК, поврежденных УФ-излучением, в результате воздействия видимого света. Она открыта И. Ф. Ковалевым, А. Келнером и Р. Дульбекко в 1948 г. Эти ученые проводили опыты над инфузориями, парамециями, коловратками, бактериями и бактериофагами.
Факторы, определяющие эффективность фотореактивации: уровень рН; температура; физиологическое состояние клетки.
Восстановительный эффект при фотореактивации связан с действием фермента дезоксирибозидпиримидинфотолиазы – полипептида, ассоциированного для его активности с небольшой молекулой РНК (10-15 нуклеотидов).
Под влиянием УФ-лучей в одной цепи ДНК образуются димеры двух соседних пиримидинов (тиминовые димеры) циклобутанового типа. Каждый из димеров задерживает репликацию на 10 сек. Процесс регенерации оснований-мономеров активируется под действием видимого света с длиной волны 300–600 нм и осуществляется под действием специфических фотореактивирующих ферментов. Фотолиаза узнает димер и расщепляет ковалентные связи между двумя пиримидинами.
Фотореактивации подвергаются только циклобутановые димеры. На данный момент это единственная известная ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Дезоксирибозидпиримидинфотолиаза широко распространена у разных органических форм и имеется даже у таких примитивных микроорганизмов, как микоплазмы. Она есть у всех изученных бактерий, кроме Micrococcus radiodurans, которые чрезвычайно устойчивы к действию УФ-лучей и выдерживают дозы в 1000 раз более высокие, чем те, что летальны для E.coli. Фотолиаза обнаружена в клетках многих растений и животных, в том числе и у человека.
Эксцизионная репарация – удаление неправильно спаренных или поврежденных оснований из ДНК и синтез новых последовательностей, взамен удаленных поврежденных. Данная репарация является наиболее распространенной. В ее основе лежит распознавание модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. С помощью данной репарации могут исправляться не только пиримидиновые димеры, но и многие другие повреждения структуры ДНК.
В эксцизионной репарации принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает не только поврежденный, но и соседние с ним нуклеотиды. Для этой репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рисунке 1.
Рисунок 1 – Схема эксцизионной репарации
Механизм эксцизионной репарации состоит из нескольких стадий:
1. Измененный участок, который несет повреждение в цепи ДНК, узнается и удаляется с помощью специфических ДНК-эндонуклеаз. Они осуществляют гидролиз фосфодиэфирных связей с 5'-конца от повреждения, а 5'→3' – экзонуклеаза и затем удаляют поврежденный участок.
2. Ресинтез ДНК – заполнение образовавшейся бреши, при этом одноцепочечный участок ДНК используется в качестве матрицы.
3. ДНК – лигаза ковалентно сшивает 3'-конец нового материала с 5'-концом старого материала.
Рекомбинационная репарация происходит с участием рекомбинации. Данный тип репарации основан на процессах рекомбинации и репликации, поврежденной ДНК.
Бреши в цепях ДНК образовываются в тех случаях, когда системы репарации оказываются нарушенными. Они имеют существенные размеры, что может привести к гибели клеток. В этом случае клетка может использовать механизм рекомбинации.
У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А. Данный белок связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК. В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК. При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи. Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы.
SOS-репарация – медленная репликация с участием системы ферментов, которую индуцирует облучение. М. Радман предположил существование этой системы в 1974 г. Она работает тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. Для данного случая характерна индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах (таблица 1).
Таблица 1 – Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК
Гены |
Последствия активации гена |
uvr А, В, С, D |
репарация повреждений вторичной структуры ДНК |
Rec А |
пострепликативная репарация, индукция SOS-системы |
lex А |
выключение SOS-системы |
rec N, ruv |
репарация двунитевых разрывов |
Ssb |
обеспечение рекомбинационной репарации |
umu С, D |
мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы |
sul А |
подавление клеточного деления |
Гены, определяемые количеством повреждений в ДНК, приводят к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).
Данный вид репарации наиболее изучен у Е. Сoli. Белки являются главными участниками, которые кодируются генами Rec A и Lex А.
Rec A представляет собой полифункциональный белок, который участвует в рекомбинации ДНК, регуляции транскрипции генов фага λ.
Lex А – репрессор транскрипции большой группы генов, который предназначен для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.
Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации.
SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных и человека.