3. Полуконсервативный способ репликации. Опыты Мезельсона и Сталя

В исходной молекуле ДНК две цепи расходятся вследствие разрыва водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из цепей – это матрица для образования новой цепи ДНК. Возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют две цепи: старую и новую. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, которая состоит из старой и новой цепи (рисунок 8).

Полуконсервативный способ репликации был доказан Дж. Тейлором в 1958 г. на митотических клетках корешков бобов. Семена бобов проращивались на среде, содержащей тимидин, в составе которого присутствовал радиоактивный водород ³Н. Радиоактивная метка включалась в ДНК и обнаруживалась в хромосомах делящихся клеток с помощью радиоаутографии.

Рисунок 8 – Схема полуконсервативной репликации ДНК

В нормальной среде после одного деления клеток метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хромосом, однако ее количество было меньшим наполовину, так как метка оставалась только в материнской нити ДНК, а вновь синтезированная нить была уже без метки. После второго деления одна хроматида содержала метку, а в другой она отсутствовала. Результаты опыта позволяют предположить, что хроматида состоит из одной молекулы ДНК и ДНК реплицируется полуконсервативно.

Доказательство полуконсервативного характера было представлено М. Мезельсоном и Ф. Сталем в 1958 г. В эксперименте работа велась с ДНК меченными ¹⁵N и ¹⁴N. В первом случае плотность ДНК составляет 1,724, а во втором – ¹⁴N г/см³. С целью их разделения ученые применили центрифугирование в градиенте плотности, устанавливаемом при высокой скорости в течение 50-60 часов водного раствора хлористого цезия 6М концентрации. В таком градиенте плотности хлористого цезия ДНК, когда она достигает седиментационного равновесия, образует полосу на уровне той плотности градиента, которая соответствует ее собственной (рисунок 9).

Рисунок 9 – Центрифугирование ДНК в градиенте плотности.

Бактерии Е. coli выращивали на протяжении 14 поколений на среде, содержащей радиоактивный азот (¹⁵N), для того, чтобы вся ДНК включила ¹⁵N и стала «тяжелой». Затем клетки синхронизировали и пересадили в среду с изотопом азота ¹⁴N, чтобы вновь синтезированные цепи ДНК стали «легкими».

Из клеток, выращиваемых на среде с легким (¹⁴N) начиная с первой генерации, выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности CsCI.

4. Ферменты репликации, схема репликационной вилки, особенности репликации днк у про- и эукариот

В репликации участвуют следующие ферменты:

1.Хеликазы

2. Белки инициации репликации DnaA, DnaB, DnaC (рисунок 10),

3. SSB-белки

4. ДНК-праймаза (РНК-полимераза)

5. ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза Ι; ДНК-полимераза ΙΙ; ДНК-полимераза ΙΙΙ.

6. ДНК-лигаза.

Рисунок 10 – Белок DnaA – инициатор репликации

ДНК-топоизомеразы – изменяют степень сверхспирализации ДНК путем внесения одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в ДНК;

ДНК-хеликаза – разделяет двухцепочечную ДНК на одинарные цепи;

ДНК-полимеразы – катализируют синтез дочерних цепей на матрице ДНК по принципу комплементарности;

ДНК-лигаза – сшивает одноцепочечные фрагменты ДНК.

Хеликазы – это ферменты, которые способны расплетать две комплементарные нити ДНК с использованием энергии, полученной при гидролизе АТФ.

У бактерий имеется две хеликазы – хеликаза Rep и хеликаза DnaB.

Хеликаза Rep продвигается от 3’-конца к 5’-концу цепи ДНК, служащей матрицей для ведущей цепи ДНК.

Хеликаза DnaB продвигается по противоположной цепи, служащей для синтеза запаздывающей цепи.

Роль ssb-белков заключается в том, что они связываются с однонитчатой ДНК, выпрямляют ее и блокируют образование шпилечных двухнитчатых структур (рисунок 11).

SSB-белки обнаружены в 1968 г. Они снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40◦С и связываются с ДНК электростатически.

Рисунок 11 – Структура ssb-белков

У ssb-белков повышенное сродство к одноцепочечной ДНК, с которой они связываются, не закрывая азотистые основания. Они крепятся по всей длине разделившихся цепей и предотвращают их комплементарное скручивание, образование «шпилек». Белки не связываются с двуцепочечной ДНК, не имеющей расплавленных участков.

Репликационная вилка – Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся расхождением двух ее цепей, в пределах которой происходит активная репликация ДНК (рисунок 12).

Рисунок 12 – Схема репликационной вилки

Репликация молекул ДНК у прокариот протекает несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК разрывается, и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча». У бактерий скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к нитке-матрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов – порядка 900. У эукариот процесс репликации несколько медленнее. У них дочерняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту.

ДНК всех живых существ устроена одинаково, но различается коэффициентом видоспецифичности, который представляет собой отношение молекулярной суммы А+Т к молекулярной сумме Г+Ц. Видоспецифичность ДНК выражается процентом или долей в ней ГЦ-пар.

ДНК-полимеразы эукариот:

– для репликации ядерной ДНК: полимеразы α, ϭ ,ϵ;

– для репликации митохондриальной ДНК: полимераза γ.

Для репарации ДНК: полимеразы β, ϵ, κ, μ, η.

Способы репликации различных геномов:

1. Репликация по типу глазка или θ – структуры (для кольцевых геномов).

2. Репликация по типу множественных глазков при репликации хромосом эукариотических организмов.

3. Репликация по типу крутящегося кольца (для хромосомы Е.coli во время коньюгации, а также для геномов бактериофагов и многих вирусов).

4. Репликация по типу D-петли (репликация хлоропластов и митохондрий) (рисунок 14).

Рисунок 14 – Репликация хлоропластных и митоходриальных геномов