3. Трансформация

Трансформация бактерий – это перенос ДНК, изолированной из одних клеток, в другие.

При трансформации ДНК, выделенную из клеток одного штамма, поглощают клетки другого штамма – реципиента.

Трансформация возможна у целого ряда бактерий: Diplococcus, Hemophilus, Neisseria, Bacillus, а также у актиномицетов, цианобактерий и других, и она имеет общие закономерности. Лучше всего трансформация изучена у таких бактерий, как D. pneumoniae, В. subtilis, Н. influenzae.

Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток. Обычно трансформирующая ДНК имеет молекулярную массу около 1×10⁷ Д, что составляет около 0,5% бактериальной хромосомы. ДНК, связанная с компетентными клетками, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов с молекулярной массой 4-5×10⁶ Д. После этого фрагменты ДНК проникают в клетку. Некоторые бактерии, в частности пневмококки, могут неспецифически поглощать ДНК из разных источников. В то же время, например, Hemophilus, поглощает только свою, гомологическую ДНК.

Фрагменты менее 5-10⁵ Д в клетку не проникают.

После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную: одна нить ДНК деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки-реципиента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется с ДНК реципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение 10-30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляет около 1%.

Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например, в организме инфицированного животного – для Diplococcus pneumoniae, а также в условиях культуры – для Bacillus sublilis. Это означает, что трансформация – не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс.

В то же время в последние годы в связи с развитием генной инженерии широко применяется плазмидная трансформация, которая заключается во введении в клетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды.

4. Трансдукция. Использование бактериофагов для картирования хромосомы бактерий

Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер. Перед рассмотрением трансдукции важно изучить взаимоотношения между бактериями и бактериофагами.

Вирулентные и умеренные бактериофаги. Бактериофаги, или вирусы бактерий, делят на две категории: вирулентные и умеренные. Вирулентный бактериофаг, проникая в клетку, вызывает литическую реакцию, т.е. размножается и лизирует бактерию. Умеренные бактериофаги могут вызывать как литическую, так и лизогенную реакцию. В последнем случае инфицирующий фаг переходит в состояние профага, который воспроизводится синхронно с хромосомой бактерии. Бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Лизогенные бактерии приобретают иммунитет, т.е. устойчивость к дополнительному заражению тем же бактериофагом, который их лизогенизировал.

Лизогенное состояние устойчиво воспроизводится. Профаг при этом теряется с частотой около 1 на 105-106 клеточных делений. В лизогенных культурах может происходить индукция бактериофага, в результате чего наблюдается массовый лизис бактерий. Такое явление происходит спонтанно и стимулируется целым рядом агентов, повреждающих ДНК: ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами, алкилирующими соединениями, органическими перекисями и т.д.

Виды трансдукции:

1. Общая трансдукция. Трансдукцию осуществляют умеренные бактериофаги. К их числу относится фаг Р22, при помощи которого Н. Зиндер впервые обнаружил трансдукцию у Salmonella typhimurium.

Два штамма этой бактерии, нуждавшиеся в аминокислотах (один – phe trp tyr ++, другой – + + met his), высевали в смешанной культуре на минимальную среду. В результате появились прототрофные колонии с частотой около 1×10^-4. Как видно, логика эксперимента была та же, что и при поисках конъюгации у Е. coli. Иными оказались результаты выращивания двух названных штаммов S. typhimurium в разных отростках U-образной трубки, разделенных бактериальным фильтром. Рекомбинанты были получены и в этом случае. Следовательно, для их образования не нужен контакт между клетками, как при конъюгации.

Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов. В одних случаях привнесенный ген наследуется стабильно, поскольку интегрирует с хромосомой реципиента. Это полная трансдукция. В других случаях при абортивной трансдукции внесенный фагом фрагмент генома не реплицируется и передается по одной линии при размножении трансдуктанта, т.е. из двух клеток – потомков каждого деления – лишь одна получает трансдуцированный ген. Так можно трансдуцировать ген, определяющий наличие жгутика у S. typhimurium. В этом случае во всем клоне – потомстве трансдуктанта – жгутик, а, следовательно, подвижность сохраняет только одна клетка. Абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная, иногда в 10 раз.

2. Специфическая трансдукция отличается от неспецифической тем, что бактериофаг может переносить только определенные гены, как это характерно для фага к Е. coli, который может трансдуцировать только гены локуса gal, ответственного за усвоение галактозы, и bio – гены синтеза биотина. Умеренный бактериофаг при лизогенизации Е. coli интегрирует в ее хромосому на участке между локусами gal и bio. Это было показано в конъюгационных скрещиваниях лизогенных Hfr и нелизогенных F^--бактерий. Gal⁺-трансдуктанты возникают обычно с частотой 1×10^-5-10^-6 и, как правило, генетически нестабильны. Они выщепляют клетки Gal^-1 частотой около 2×10^-3 на клеточное деление. Это явление объясняется тем, что трансдуктанты Gal⁺ частично гетерозиготны gal/gal⁺ т.е. несут дополнительный фрагмент gal⁺ вместе с участком gal реципиента. Такое состояние называется гетерогенотой.

При облучении гетерогенот УФ-лучами удалось получить фаголизаты, способные к трансдукции с очень высокой частотой.

Почти половина всех частиц λ могла передавать признак Gal⁺ при трансдукции. Изучение фагов из таких лизатов, названных HFT (от англ. high frequency transduction), показало, что гены gal переносят так называемые дефектные фаги λ, т.е. такие, которые, лизогенизируя бактерии, сообщают им устойчивость к суперинфекции λ, но в дальнейшем лизогенные бактерии не способны продуцировать инфекционные частицы бактериофага. Дефектные трансдуцирующие частицы λ, обозначаемые к gal, не образуют стерильных пятен на газоне Е. coli. Они не могут самостоятельно размножаться. Для этого им требуется фаг – помощник: нормальный, не способный к трансдукции.