4. Понятие об интерференции и коинциденции
Практический (или наблюдаемый) двойной кроссинговер можно определить по результатам трехфакторного анализирующего скрещивания как долю двойных кроссоверных гамет. При этом практический двойной кроссинговер происходит, как правило, с меньшей частотой, чем теоретически ожидаемый двойной кроссинговер (определяется как произведение частот одиночных кроссинговеров). Это противоречие возникает в силу положительной интерференции – явления, при котором кроссинговер, происходящий на одном участке, препятствует одновременному прохождению кроссинговера на соседнем участке. Значение интерференции определяется по формуле:
I=1
C,
где: С – коэффициент коинциденции (или коэффициент совпадения).
По мере уменьшения двух расстояний, разделяющих три гена, интерференция увеличивается. Величина интерференции измеряется с помощью коэффициента коинциденции т.е. совпадения. Содержание понятия «коинциденция» противоположно содержанию понятия «интерференция». Коэффициент коинциденции определяется как частное от деления фактически полученной величины двойных кроссоверов на их ожидаемое число.
С=
Например, если частота кроссинговера между генами Y и W – 1,5%, между W и M 32,5%, а частота двойных кроссинговеров равна 0,04%, то коэффициент коинциденции будет составлять:
С=
=0,00353
Коэффициент коинциденции (С) – отношение наблюдаемого числа кроссинговера (двойного перекреста) к теоретически ожидаемому, измеряется в долях или процентах.
С=0 – интерференции нет, фактическая и ожидаемая частоты совпали (нет влияния одного кроссинговера на другой).
C>1 – интерференция отрицательная и один кроссинговер стимулирует другой.
C<1 – интерференция положительная и один кроссинговер тормозит другой.
У дрозофилы на коротких участках хромосом, которые равны или меньше 10 единиц кроссинговера, двойные кроссоверы вообще не происходят. На участках, отстоящих друг от друга более чем на 40 единиц перекреста, двойные перекресты происходят уже по правилам свободных сочетаний друг с другом. Здесь С = 1, ибо имеется полное совпадение фактического числа двойных кроссоверов с их ожидаемым числом.
Причины интерференции неизвестны. Считалось, что это связано с упругостью хромосом. Сейчас выделяют другую причину – конкуренцию за фермент.
3.5 Рекомбинация у бактерий и вирусов план
1. Микроорганизмы как объект генетических исследований.
2. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов
3. Трансформация.
4. Трансдукция. Использование бактериофагов для картирования хромосомы бактерий.
5. Конъюгация бактерий.
1. Микроорганизмы как объект генетических исследований
Микроорганизмы, используемые в качестве модельных генетических объектов, отличаются относительной простотой их организации. Большинство используемых в генетических экспериментах микроорганизмов являются одноклеточными. Структурная организация вирусов и фагов еще проще – лишены клеточной организации. Простота организации как-бы сокращает путь от гена до проявления, контролируемого этим геном признака. Таким образом, фенотипическое проявление многих генов оказалось возможным изучать на биохимическом уровне по проявлению активности отдельных ферментов.
Микроорганизмы быстро размножаются и их легко культивировать в лабораторных условиях на искусственных питательных средах. На плотной питательной среде можно получить от одной исходной клетки колонию генотипически однородных клеток, а затем размножить их до большого количества, что необходимо для биохимического и молекулярного анализа. У микроорганизмов достаточно легко получать самые разнообразные мутации. Гаплоидность многих микроорганизмов обеспечивает проявление рецессивных мутаций, которые у диплоидных организмов могут быть «замаскированы» присутствием нормальной аллели.
В генетических экспериментах на микроорганизмах широко используются ауксотрофные мутации. Клетки большинства микроорганизмов способны синтезировать необходимые им для нормальной жизнедеятельности аминокислоты, азотистые основания, витамины из неорганических соединений в присутствии источника энергии (чаще всего глюкозы). Такие клетки называют прототрофными, или клетками дикого типа. Штаммы дикого типа можно выращивать на минимальной питательной среде с относительно простым составом. Такая среда содержит набор неорганических соединений в определенной комбинации и источник энергии в виде углевода. Клетка, утратившая в результате мутации способность к биосинтезу того или иного соединения, называется ауксотрофной.
Клетки ауксотрофных штаммов, в отличие от клеток дикого типа, не способны расти на минимальной питательной среде. Однако если в минимальную среду добавить вещество, синтез которого утрачен в результате мутации, способность мутантных клеток к росту восстанавливается. Минимальная среда с необходимыми для роста ауксотрофов питательными добавками получила название селективной среды. Селективные среды позволяют отбирать определенный класс мутантов.
Значительно ускоряет работу по генетической идентификации отдельных колоний метод «отпечатков» колоний, предложенный Д. Ледербергом. С помощью этого метода можно за один прием переносить на чашки Петри с разными селективными средами до сотни отдельных колоний. На рисунке 1 изображено приспособление для переноса отпечатков колоний, иллюстрирующее сущность этого метода.
Рисунок 1 – Бархатный штамп для снятия отпечатков колоний с чашек Петри:
1– агаризованная среда с исходными колониями на поверхности; 2 – бархат; 3 – чашка Петри; 4 – ободок; 5 – цилиндр
Селективные среды с успехом применяются при проведении генетического анализа. Они позволяют полностью исключить рост родительских штаммов и отбирать только рекомбинантные клетки, даже если рекомбинация между маркерами происходит с низкой частотой. Использование селективных сред позволяет выделить одну рекомбинантную клетку среди 107–108 родительских клеток. Высокая чувствительность этого метода позволила повысить разрешающую способность генетического анализа и проводить тонкое генетическое картирование, т.е. определять местоположение мутантных сайтов внутри гена.