37. Иммунофлюоресценция, прямой и непрямой методы. Цель постановки, значение для диагностики инфекционных заболеваний.
Иммунофлюоресценция (РИФ) - это метод, при котором используют антитела, меченные специальным веществом — флюорохромом(светящимся красителем). Эти антитела связываются с антигенами и в люминесцентном микроскопе в УФ-свете светятся, что видно наблюдателю.
Метод позволяет быстро обнаружить микроб или его антиген в материале — поэтому его называют экспресс-диагностикой.
Цель РИФ
-Прямо на месте определить, есть ли в образце возбудитель или его антиген.
-Иногда — найти антитела к возбудителю в сыворотке.
Применяется для диагностики инфекций: например, бешенство, туляремия, хламидиоз, микоплазмоз, вирусные инфекции.
1 Прямой РИФ
Используются антитела, уже меченные флюорохромом.
Эти антитела напрямую связываются с антигеном (например, с микробом).
Мазок смотрят в люминесцентный микроскоп → микробы светятся (обычно зелёной каймой по
периферии).
Когда используют: когда нужно быстро найти сам антиген или микроб в мазке.
2 Непрямой РИФ
Сначала добавляют немеченые антитела к антигену (например, кроличьи антимикробные антитела).
Эти антитела связываются с микробами → затем добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против первых антител), которая
уже мечена флюорохромом. //ЧТО БЛЯДЬ… ну короче, мы не ищем легких путей… сначала мы добавляем АТ к микробу они обычные не светятся, а вот потом мы добавляем АТ а ЭТИМ СУКА АТ и они уже светятся… они не бесполезные они светятся…
В итоге светится комплекс: микроб + первые антитела + вторые антитела
с флюорохромом.
Когда используют: если нужно повысить чувствительность метода
(непрямой метод чувствительнее прямого). // как всегда логично…
Что видно под микроскопом?
-Если антиген есть → он светится (обычно зелёным светом в УФ-лучах).
-Если антигена нет → ничего не светится.
Значение РИФ в диагностике
-Быстрая диагностика инфекций (буквально за 1-2 часа).
-Точная идентификация микробов в мазках, биоптатах, тканях.
-Высокая чувствительность и специфичность.
38. ИФА, цель постановки, ингредиенты, механизм, учет.
Иммуноферментный анализ (ИФА) — это серологический метод, основанный на специфическом взаимодействии антигена с антителом, при котором один из компонентов (обычно антитело) связан с ферментной меткой. После связывания комплекса антиген–антитело добавляют субстрат, который расщепляется
ферментом и вызывает изменение окраски. Интенсивность окраски пропорциональна количеству образовавшихся комплексов.
//КОРОЧЕ И ДЛЯ ТУПЫХ У нас есть антитело, оно как бы на дне чашки (как мы все с вами епта)... ты наливаешь в чашку
кровь пациента в которой либо есть АТ/АГ либо нет. Если вещество есть то оно прилипнет ко дну где у нас все еще АГ наше лежит… После чего мы наливаем какую то херню с ферментом если у нас на прошлом этапе все прилипло то здесь субстрат прилипнет еще сверху, а потом мы все это еще сверху поливаем “красителем” то есть субстратом… я вот думаю че блядь за пирамидка получается…
Цель постановки ИФА
Обнаружение и количественная оценка: -специфических антител в сыворотке; -специфических антигенов инфекционных агентов;
-гормонов, лекарственных веществ, ферментов и других биологически активных соединений в малых концентрациях.
Ингредиенты ИФА
1 Антиген или антитело, сорбированные на твёрдой фазе (например, лунках полистиролового
планшета). 2 Антитела или антигены с ферментной меткой (чаще всего ферменты: пероксидаза хрена, щелочная
фосфатаза, β-галактозидаза). 3 Субстрат + хромоген (для выявления активности фермента).
4 Промывочные растворы (для удаления несвязавшихся компонентов).
Механизм проведения ИФА
1 В лунки планшета с сорбированным антигеном или антителом добавляют исследуемый материал (сыворотку пациента).
2 Инкубация: если в образце есть специфический антиген или антитело — они связываются с
сорбированным компонентом. 3 Промывание: удаляют несвязавшиеся вещества.
4 Добавляют антитела или антигены с ферментной меткой → они связываются с образовавшимся комплексом. 5 Промывание.
6 Добавляют субстрат → фермент расщепляет его, возникает окрашивание.
7 Учет: измеряют интенсивность окраски с помощью спектрофотометра (фотометрия).
Виды ИФА 1 Прямой ИФА (определение антигена)
Антитело сорбировано на твердой фазе.
Вносят образец с антигеном → связывается. Добавляют антитело с ферментом → связывается.
Добавляют субстрат → окраска.
2 Непрямой ИФА (определение антител)
Антиген сорбирован на твердой фазе.
Добавляют сыворотку пациента (антитела).
Промывание.
Добавляют антиглобулиновое антитело с ферментом (против антител человека).
Добавляют субстрат → окраска.
3 Конкурентный ИФА
Для антигена: антиген пациента и меченый антиген конкурируют за антитела на твердой фазе. Чем больше антигена пациента, тем меньше окраска.
Для антител: антитела пациента и меченые антитела конкурируют за антиген на твёрдой фазе. Чем больше антител пациента, тем меньше окраска.
Учет результата
-Измеряют интенсивность окраски с помощью фотометра (спектрофотометра).
-Результаты выражают в условных оптических единицах или сравнивают с калибровочными стандартами.
-Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству искомого антигена или антитела (за исключением конкурентного варианта, где наоборот).
39. Инвазивность. Ферменты инвазии и методы их определения.
Инвазивность — это способность микроорганизмов проникать в ткани организма, распространяться в нём и преодолевать защитные барьеры макроорганизма. Инвазивность относится к числу важнейших факторов вирулентности патогенных микробов.
Она зависит от выделяемых микробами продуктов жизнедеятельности, которые разрушают ткани и способствуют проникновению, а также от состояния макроорганизма — активности фагоцитов, состояния ретикулоэндотелиальной системы, бактерицидности крови. В пределах одного вида микробов разные штаммы могут обладать разной степенью инвазивности. Как правило, молодые культуры более инвазивны, чем старые.
Инвазивность определяет возможность генерализации инфекции, тяжесть течения заболевания и его исход.
Ферменты инвазии и их функции Гиалуронидаза разрушает гиалуроновую кислоту — основное вещество, скрепляющее клетки
соединительной ткани. Это облегчает продвижение микробов через межклеточные пространства. Нейраминидаза расщепляет сиаловые кислоты, входящие в состав рецепторов клеток слизистых оболочек. Это делает клетки более уязвимыми для прикрепления микробов и действия их токсинов. Фибринолизин растворяет сгустки фибрина, которые образуются в очаге воспаления. Это помогает микробам распространяться по тканям, минуя защитные барьеры организма.
Коллагеназа разрушает коллаген — основной белок соединительной ткани. Это обеспечивает более
глубокое проникновение микробов в ткани.
Лецитиназа разрушает лецитин мембран мышечных клеток, эритроцитов и других клеток, что приводит к их повреждению и облегчает распространение возбудителя.
Коагулаза вызывает свертывание плазмы крови. В результате микробы как бы «укрываются» в фибриновых капсулах и становятся менее доступны для фагоцитов.
ДНКаза разрушает ДНК, снижает вязкость гнойных масс, что облегчает распространение микробов в
очаге инфекции.
Протеазы расщепляют белки, включая антитела, что способствует уклонению микробов от гуморальных механизмов защиты.
Методы определения инвазивности
Инвазивность определяют с помощью опытов на животных, при которых изучают способность микробов
вызывать генерализацию инфекции и проникать в ткани. Также применяются биохимические методы
для выявления активности ферментов инвазии в культуральной жидкости. Для некоторых ферментов
существуют специальные тесты: например, тесты на гиалуронидазу или коагулазу.
Значение
Инвазивность определяет способность возбудителя преодолевать барьерные ткани организма и
распространяться в нём, что оказывает влияние на тяжесть инфекции, скорость её распространения и исход заболевания.
40. Факторы патогенности бактерий с антифагоцитарной активностью. Классификация, свойства, химический состав, локализация.
Факторы патогенности с антифагоцитарной активностью — это структуры и вещества бактерий,
которые позволяют им уклоняться от фагоцитоза, то есть от захвата и уничтожения фагоцитами
(макрофагами, нейтрофилами). Эти факторы помогают возбудителю выживать в организме и способствуют развитию инфекции.
Классификация антифагоцитарных факторов
1 Капсульные вещества
2 Поверхностные белки (протеины)
3 Механизмы блокировки опсонизации (антител и комплемента)
Свойства антифагоцитарных факторов
-Блокируют связывание бактерий с фагоцитами.
-Нарушают процесс опсонизации (когда антитела и комплемент «помечают» бактерии для захвата).
-Защищают бактерии от действия лизосомальных ферментов.
-Повышают устойчивость бактерий к действию иммунных факторов.
Основные антифагоцитарные структуры и их характеристика 1 Капсульное вещество
—Состав: полисахариды (например, у пневмококка, возбудителя сибирской язвы), иногда белково-полисахаридные комплексы.
—Свойства: капсула препятствует взаимодействию бактерии с фагоцитом, защищает от действия опсонинов и комплемента.
—Локализация: на поверхности бактериальной клетки.
—Пример: капсула Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae.
Капсулы некоторых стрептококков содержат гиалуроновую кислоту. Такие капсулы мимикрируют под собственные ткани организма, не распознаются фагоцитами и не подвергаются фагоцитозу.
2 Поверхностные белки
— М-протеин (у β-гемолитического стрептококка группы А)
Связывает фибриноген → блокирует связывание с комплементом и препятствует фагоцитозу.
— А-протеин (у стафилококков)
Связывается с Fc-фрагментами иммуноглобулинов → предотвращает их нормальную работу в качестве опсонинов.
3 Другие механизмы
Некоторые микроорганизмы выделяют вещества, которые инактивируют комплемент или антитела,
подавляют хемотаксис лейкоцитов. Например:
— Липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий (например, эшерихий) может тормозить активацию комплемента.
Химический состав и локализация
-Капсулы — чаще полисахаридные (у пневмококков, менингококков), иногда белково-полисахаридные (у Bacillus anthracis).
-Поверхностные белки — белки клеточной стенки (например, М-протеин, А-протеин). -Локализация — внешние структуры бактериальной клетки: капсульный слой, клеточная стенка.
Значение антифагоцитарных факторов
- Помогают бактериям избегать уничтожения иммунной системой.
- Способствуют выживанию и распространению возбудителя в организме. - Усиливают инвазивность и вирулентность микроорганизма.
//Для запоминания Капсула = броня против фагоцитов
М-протеин = щит стрептококка от комплемента А-протеин = обман антител у стафилококка
41. Фагоцитоз, его стадии и характеристика каждой стадии. Незавершенный фагоцитоз. Примеры.
Фагоцитоз — это процесс захвата и переваривания клетками (фагоцитами) твердых частиц (бактерий,
клеточного детрита, старых клеток).
Стадии фагоцитоза 1 Хемотаксис
Перемещение фагоцитов к объекту под действием хемоаттрактантов (цитокины, лейкотриен В4, гистамин, С3а, С5а, тромбин и др.)