63. Методы культивирования вирусов: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей. Типы клеточных культур, применяемые в вирусологии. ЦПД вируса на клетку.

Культивирование вирусов — это выращивание вирусов в живых клетках для: диагностики (выделение вируса), изучения их свойств, производства вакцин, оценки действия препаратов, научных исследований.

Так как вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты, они не размножаются на питательных средах, как бактерии. Им нужны живые клетки-хозяева.

Методы культивирования вирусов:

1. Культивирование на животных (in vivo)

Суть: вирус вводят животному — мышам, морским свинкам, кроликам, хомякам и др. Применение: когда вирус не растёт в культуре клеток. Для оценки патогенности, нейротропности. В исследованиях, испытании вакцин, онковирусов.

Примеры: вирус бешенства — мыши (наблюдают за развитием параличей). Вирусы герпеса, полиомиелита, энцефалита.

Недостатки: этичность и сложность. Долгий процесс. Высокие затраты. Некоторые вирусы требуют строго определённого животного вида.

2. Культивирование в куриных эмбрионах (in ovo)

Суть: куриный эмбрион (9–12-дневный) — стерильная, хорошо васкуляризированная, многообразная среда, подходящая для роста разных вирусов.

Применение: широко используется в вирусологии и производстве вакцин (особенно против гриппа). Подходит для вирусов, не размножающихся в культуре клеток.

Способы заражения (вводят в разные среды):

Преимущества: стерильность. Доступность. Отсутствие этических проблем.

3. Культивирование в культуре клеток (in vitro)

Это основной и наиболее универсальный метод в современной вирусологии.

Суть: клетки выращивают вне организма (в питательной среде), заражают вирусом, наблюдают за размножением и эффектами.

Типы клеточных культур:

Цикл работы с клеточной культурой:

1.​ Засевают клетки в пробирки/флаконы → формируют монослой. 2.​ Вводят вирус.

3.​ Инкубируют при 35–37°C.

4.​ Наблюдают ЦПД (цитопатический эффект) или применяют специальные методы выявления (ИФА, ПЦР, гемадсорбция и т.д.).

ЦПД (цитопатическое действие вируса)— изменения, вызванные вирусом в инфицированной клетке, ведущие к её разрушению или изменению формы.

Проявления ЦПД:

Методы оценки ЦПД:

Световая микроскопия (наблюдение форм и разрушения). Окрашивание живых/мертвых клеток

(например, трипановый синий). Метод бляшек. Электронная микроскопия. ИФА/ПЦР — для скрытых инфекций, без ЦПД.

64. Принципы диагностики вирусных инфекций. Вирусная гемагглютинация. Гемадсорбция. Цветная реакция. Метод бляшек. Типирование вирусов по реакциям торможения (нейтрализации).

Принципы диагностики вирусных инфекций

Общие принципы диагностики вирусных инфекций

Диагностика вирусных инфекций отличается от диагностики бактериальных, так как вирусы: не растут на обычных питательных средах; часто находятся внутри клеток; дают слабую воспалительную реакцию на уровне ткани; требуют более сложных и специфических методов.

Основные цели диагностики:

1.​ Подтвердить наличие вирусной инфекции.

2.​ Определить конкретный вирус. 3.​ Определить его тип/штамм. 4.​ Оценить стадию заболевания.

Основные группы методов диагностики:

Отличие от ВГА: при ВГА вирус сам "склеивает" эритроциты в растворе. При гемадсорбции —

эритроциты приклеиваются к мембране заражённой клетки, потому что там экспрессируются вирусные белки.

Значение: позволяет обнаружить вирус, даже если он не вызывает явного разрушения клеток (ЦПЭ). Используется для гриппа, парагриппа, кори, вируса Ньюкасла.

Порядок проведения:

1.​ Инфицируют монослой клеток вирусом. 2.​ Через 1–2 суток добавляют эритроциты.

3.​ Наблюдают — если клетки заражены, эритроциты пристанут.

3. Цветная реакция (метод vital staining)

Суть: некоторые вирусы разрушают клетки, вызывая цитопатический эффект. Можно использовать окраску живых клеток (например, трипан синий, нейтральный красный), чтобы различить: живые клетки — не окрашиваются; мёртвые или повреждённые — окрашиваются, так как теряют мембранную избирательность.

Применение: для выявления ЦПЭ, оценки действия вируса. Часто сочетается с другими методами (например, метод бляшек).

4. Метод бляшек (Plaque assay)

Суть: при заражении монослоя клеток вирусом, который вызывает цитопатический эффект,

образуются участки погибших клеток — бляшки. Как проводится:

1.​ Культура клеток заливается вирусом в разных разведениях.

2.​ Добавляют полужидкую среду (например, агар), чтобы вирусы не распространялись по всей чашке, а только локально.

3.​ Через 1–2 дня клетки фиксируют и окрашивают (например, кристаллическим фиолетом).

4.​ Видны прозрачные зоны — бляшки, каждая из которых возникла от одного вируса.

Значение: позволяет подсчитать концентрацию вируса — по числу бляшек (в PFU — plaque-forming units). Применяется для оценки активности вируса, оценки эффективности антивирусных препаратов, выделения мутантов.

5. Типирование вирусов по реакциям торможения Этот блок включает два родственных метода:

А) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Используется при работе с вирусами, обладающими гемагглютинирующими свойствами (грипп, парагрипп и др.).

Суть: если в пробирке смешать вирус и специфические антитела к нему, то антитела свяжут гемагглютинины, и вирус потеряет способность агглютинировать эритроциты.

Интерпретация:

Нет агглютинации = антитела сработали = вирус определённого типа. Метод чувствителен, используется для типирования и подтверждения диагноза.

Применяется: в эпидемиологии гриппа (подтип HxNx). Для выявления иммунного ответа.

Б) Реакция нейтрализации (РН)

Суть: вирус инкубируют с сывороткой, содержащей антитела. Если антитела специфические,

то они связывают вирус и не дают ему заразить клетки.

Как проводится:

1.​ Смесь вируса и сыворотки вносят на клетки. 2.​ При отсутствии ЦПЭ → вирус нейтрализован.

3.​ При наличии ЦПЭ → вирус не нейтрализован → антитела не подходят.

Применение: для типирования (например, полиовирусов, вирусов Коксаки, ECHO и др.). Для определения титра защитных антител. Вакцинология: оценка эффективности прививки.

Итоговая таблица (для повторения)