38. ИФА, цель постановки, ингредиенты, механизм, учет.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это серологический метод, основанный на специфическом взаимодействии антигена с антителом, при котором один из компонентов (обычно антитело) связан с ферментной меткой.​ После связывания комплекса антиген–антитело добавляют субстрат, который расщепляется

ферментом и вызывает изменение окраски. Интенсивность окраски пропорциональна количеству образовавшихся комплексов.

//КОРОЧЕ И ДЛЯ ТУПЫХ У нас есть антитело, оно как бы на дне чашки (как мы все с вами епта)... ты наливаешь в

чашку кровь пациента в которой либо есть АТ/АГ либо нет. Если вещество есть то оно прилипнет ко дну где у нас все еще АГ наше лежит… После чего мы наливаем какую то херню с ферментом если у нас на прошлом этапе все прилипло то здесь субстрат прилипнет еще сверху, а потом мы все это еще сверху поливаем “красителем” то есть субстратом… я вот думаю че блядь за пирамидка получается…

Цель постановки ИФА

Обнаружение и количественная оценка:

-специфических антител в сыворотке; -специфических антигенов инфекционных агентов;

-гормонов, лекарственных веществ, ферментов и других биологически активных соединений в малых концентрациях.

Ингредиенты ИФА

1 Антиген или антитело, сорбированные на твёрдой фазе (например, лунках полистиролового планшета).​ 2 Антитела или антигены с ферментной меткой (чаще всего ферменты: пероксидаза хрена,

щелочная фосфатаза, β-галактозидаза).​ 3 Субстрат + хромоген (для выявления активности фермента).​

4 Промывочные растворы (для удаления несвязавшихся компонентов).

Механизм проведения ИФА​

1 В лунки планшета с сорбированным антигеном или антителом добавляют исследуемый материал (сыворотку пациента).​ 2 Инкубация: если в образце есть специфический антиген или антитело — они связываются с сорбированным компонентом.​

3 Промывание: удаляют несвязавшиеся вещества.​ 4 Добавляют антитела или антигены с ферментной меткой → они связываются с образовавшимся комплексом.​ 5 Промывание.​

6 Добавляют субстрат → фермент расщепляет его, возникает окрашивание.​ 7 Учет: измеряют интенсивность окраски с помощью спектрофотометра (фотометрия).

Виды ИФА 1 Прямой ИФА (определение антигена)

Антитело сорбировано на твердой фазе.

Вносят образец с антигеном → связывается.

Добавляют антитело с ферментом → связывается.

Добавляют субстрат → окраска.

2 Непрямой ИФА (определение антител)

Антиген сорбирован на твердой фазе. Добавляют сыворотку пациента (антитела). Промывание.

Добавляют антиглобулиновое антитело с ферментом (против антител человека).

Добавляют субстрат → окраска.

3 Конкурентный ИФА

Для антигена: антиген пациента и меченый антиген конкурируют за антитела на твердой фазе. Чем больше антигена пациента, тем меньше окраска. Для антител: антитела пациента и меченые антитела

конкурируют за антиген на твёрдой фазе. Чем больше антител пациента, тем меньше окраска.

Учет результата

-Измеряют интенсивность окраски с помощью фотометра (спектрофотометра).​

-Результаты выражают в условных оптических единицах или сравнивают с калибровочными стандартами.​

-Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству искомого антигена или антитела (за исключением конкурентного варианта, где наоборот).

39. Инвазивность. Ферменты инвазии и методы их определения.

Инвазивность — это способность микроорганизмов проникать в ткани организма, распространяться в нём и преодолевать защитные барьеры макроорганизма. Инвазивность относится к числу важнейших факторов вирулентности патогенных микробов.

Она зависит от выделяемых микробами продуктов жизнедеятельности, которые разрушают ткани и способствуют проникновению, а также от состояния макроорганизма — активности фагоцитов, состояния ретикулоэндотелиальной системы, бактерицидности крови. В пределах одного вида микробов разные штаммы могут обладать разной степенью инвазивности. Как правило, молодые культуры более инвазивны, чем старые.

Инвазивность определяет возможность генерализации инфекции, тяжесть течения заболевания и его исход.

Ферменты инвазии и их функции Гиалуронидаза разрушает гиалуроновую кислоту — основное вещество, скрепляющее клетки

соединительной ткани. Это облегчает продвижение микробов через межклеточные пространства.

Нейраминидаза расщепляет сиаловые кислоты, входящие в состав рецепторов клеток слизистых оболочек. Это делает клетки более уязвимыми для прикрепления микробов и

действия их токсинов.

Фибринолизин растворяет сгустки фибрина, которые образуются в очаге воспаления. Это помогает микробам распространяться по тканям, минуя защитные барьеры организма.

Коллагеназа разрушает коллаген — основной белок соединительной ткани. Это обеспечивает более глубокое проникновение микробов в ткани.

Лецитиназа разрушает лецитин мембран мышечных клеток, эритроцитов и других клеток, что приводит к их повреждению и облегчает распространение возбудителя.

Коагулаза вызывает свертывание плазмы крови. В результате микробы как бы «укрываются» в фибриновых капсулах и становятся менее доступны для фагоцитов.

ДНКаза разрушает ДНК, снижает вязкость гнойных масс, что облегчает распространение микробов в очаге инфекции.

Протеазы расщепляют белки, включая антитела, что способствует уклонению микробов от гуморальных механизмов защиты.

Методы определения инвазивности

Инвазивность определяют с помощью опытов на животных, при которых изучают способность микробов вызывать генерализацию инфекции и проникать в ткани. Также применяются биохимические методы для выявления активности ферментов инвазии в культуральной жидкости. Для некоторых ферментов существуют специальные тесты: например, тесты на гиалуронидазу или коагулазу.

Значение

Инвазивность определяет способность возбудителя преодолевать барьерные ткани организма и распространяться в нём, что оказывает влияние на тяжесть инфекции, скорость её распространения и исход заболевания.

40. Факторы патогенности бактерий с антифагоцитарной активностью. Классификация, свойства, химический состав, локализация.

Факторы патогенности с антифагоцитарной активностью — это структуры и вещества бактерий, которые позволяют им уклоняться от фагоцитоза, то есть от захвата и уничтожения фагоцитами (макрофагами, нейтрофилами). Эти факторы помогают возбудителю выживать в

организме и способствуют развитию инфекции.

Классификация антифагоцитарных факторов

1 Капсульные вещества​

2 Поверхностные белки (протеины)​

3 Механизмы блокировки опсонизации (антител и комплемента)

Свойства антифагоцитарных факторов

-Блокируют связывание бактерий с фагоцитами.​

-Нарушают процесс опсонизации (когда антитела и комплемент «помечают» бактерии для захвата).​

-Защищают бактерии от действия лизосомальных ферментов.​

-Повышают устойчивость бактерий к действию иммунных факторов.

Основные антифагоцитарные структуры и их характеристика 1 Капсульное вещество

—Состав: полисахариды (например, у пневмококка, возбудителя сибирской язвы), иногда белково-полисахаридные комплексы.​

—Свойства: капсула препятствует взаимодействию бактерии с фагоцитом, защищает от

действия опсонинов и комплемента.​

—Локализация: на поверхности бактериальной клетки.​

—Пример: капсула Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae.

Капсулы некоторых стрептококков содержат гиалуроновую кислоту. Такие капсулы мимикрируют под собственные ткани организма, не распознаются фагоцитами и не подвергаются фагоцитозу.

2 Поверхностные белки

— М-протеин (у β-гемолитического стрептококка группы А)​

Связывает фибриноген → блокирует связывание с комплементом и препятствует фагоцитозу.​

— А-протеин (у стафилококков)​

Связывается с Fc-фрагментами иммуноглобулинов → предотвращает их нормальную работу в качестве опсонинов.

3 Другие механизмы

Некоторые микроорганизмы выделяют вещества, которые инактивируют комплемент или антитела, подавляют хемотаксис лейкоцитов. Например:​

— Липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий (например, эшерихий) может

тормозить активацию комплемента.

Химический состав и локализация

-Капсулы — чаще полисахаридные (у пневмококков, менингококков), иногда белково-полисахаридные (у Bacillus anthracis).​

-Поверхностные белки — белки клеточной стенки (например, М-протеин, А-протеин).​ -Локализация — внешние структуры бактериальной клетки: капсульный слой, клеточная

стенка.

Значение антифагоцитарных факторов

- Помогают бактериям избегать уничтожения иммунной системой.​ - Способствуют выживанию и распространению возбудителя в организме.​ - Усиливают инвазивность и вирулентность микроорганизма.

//Для запоминания Капсула = броня против фагоцитов

М-протеин = щит стрептококка от комплемента​ А-протеин = обман антител у стафилококка

41. Фагоцитоз, его стадии и характеристика каждой стадии. Незавершенный фагоцитоз. Примеры.

Фагоцитоз — это процесс захвата и переваривания клетками (фагоцитами) твердых частиц (бактерий, клеточного детрита, старых клеток).

Стадии фагоцитоза 1 Хемотаксис​

Перемещение фагоцитов к объекту под действием хемоаттрактантов (цитокины, лейкотриен В4, гистамин, С3а, С5а, тромбин и др.)​