21. История открытия трансформации. Природа и размер трансформирующего начала. Эффективность трансформации и компетентность реципиента. Механизм интеграции ДНК при трансформации.

История открытия

Понятие трансформации в бактериальной генетике возникло в 1928 году благодаря экспериментам Фредерика Гриффита. Он изучал пневмококки (Streptococcus pneumoniae) и обнаружил, что непатогенные, «гладкие» (S) штаммы можно сделать патогенными путём добавления к ним убитых теплом клеток вирулентных штаммов. Этот эффект Гриффит объяснил существованием некоего «трансформирующего начала», которое передавалось от погибших бактерий живым.

В 1944 году Освальд Эйвери совместно с коллегами (Маклеод и Маккарти) показал, что трансформирующим агентом является именно ДНК. Это было ключевым доказательством роли ДНК как носителя генетической информации.

Природа и размер трансформирующего начала

Трансформирующее начало — это двухцепочечная фрагментированная ДНК, полученная из лизированных (разрушенных) бактериальных клеток-доноров. В процессе естественной трансформации бактерия реципиент захватывает одну цепь ДНК, в то время как вторая может быть разрушена нуклеазами.

Размер трансформирующих фрагментов ограничен, и, как правило, составляет от 5 до 15 тысяч пар оснований, хотя точное число может варьировать в зависимости от вида бактерии и условий трансформации. Обычно для интеграции требуется определённый гомологичный участок, в среднем 1000–2000 п.о., для рекомбинации.

Эффективность трансформации и компетентность реципиента

Трансформация — это низкоэффективный процесс, если говорить о естественных условиях. Только небольшая часть бактериальных клеток в популяции способна к активному захвату ДНК. Такие клетки называют компетентными.

Компетентность — это состояние бактериальной клетки, при котором она способна активно захватывать экзогенную ДНК из окружающей среды. Компетентность может быть:

●​ Естественной (характерна, например, для Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae).

●​ Искусственно индуцированной — с помощью химической обработки (например, ионы Ca² ) или электропорации.

Эффективность зависит от ряда факторов:

●​ Физиологическое состояние клеток (стадия роста). ●​ Структура и размер ДНК.

●​ Наличие гомологии между фрагментами ДНК донора и хромосомой реципиента.

Механизм интеграции ДНК при трансформации

Механизм включает несколько ключевых этапов:

1.​ Признание и связывание ДНК специализированными белками на поверхности клетки. 2.​ Поглощение ДНК — внутрь клетки обычно попадает только одна из двух цепей, вторая

деградирует.

3.​ Рекомбинация: чужеродная цепь интегрируется в хромосому реципиента путём гомологичной рекомбинации — то есть замены аналогичного участка родной ДНК.

4.​ При последующем делении клетки новая генетическая информация может быть закреплена в потомстве

Интеграция требует участия рекомбиназных белков, таких как RecA, обеспечивающих поиск гомологии и обмен участками ДНК.

Гомологичная рекомбинация — это молекулярный процесс обмена генетическим материалом между двумя молекулами ДНК, имеющими сходную или идентичную нуклеотидную последовательность. У

бактерий этот механизм играет ключевую роль в рекомбинации при трансформации, конъюгации и трансдукции, а также в репарации повреждённой ДНК.

Молекулярный механизм (поэтапно)

1.​ Выравнивание гомологичных участков​

Экзогенная ДНК, попавшая в клетку, выравнивается с аналогичным (гомологичным) участком в хромосоме. Это требует высокого уровня последовательностной идентичности (обычно >90%).​

2.​ Рассечение одной из цепей ДНК​

Белки нуклеазы создают одноцепочечный разрез в одной из молекул ДНК — часто в ДНК донора.​

3.​ Белок RecA​

Это ключевой белок бактериальной рекомбинации. RecA связывается с одноцепочечной ДНК и находит участок гомологии на двухцепочечной ДНК хромосомы. Он обеспечивает инвазирование цепи — встраивание одной цепи в двойную спираль другой.​

4.​ Образование гетеродуплексной структуры​

ДНК-участок, где произошел обмен цепями, называется гетеродуплекс — он содержит одну цепь от донора и одну — от реципиента.​

5.​ Резольвация (разрешение перекреста)​

Завершается рекомбинация расщеплением и сшиванием молекул ферментами резолвазами. В результате образуется новая молекула ДНК, в которую встроен участок от донора.​