1. Основные принципы и методы культивирования бактерий. Питательные среды и их классификация. Колонии у различных видов бактерий, культуральные свойства

Культуральные свойства микроорганизмов – характер роста на искусственных питательных средах. На жидких средах микробы могут расти диффузно, пристеночно, придонно, поверхностно или формировать пленку. На плотных средах микроорганизмы образуют колонии.

Исключение составляют микробы рода Proteus, которые, являясь перитрихами, не формируют колонии на плотной питательной среде, а демонстрируют «ползучий» рост («феномен роения»)

Методы культивирования микроорганизмов.

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного

культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред.

Стационарный способ — наиболее часто используемый в лабораторной практике. Состав сред не пополняется субстратом, не проводится дополнительная аэрация( усиление снабжения микробов кислородом ) Микроорганизмы развиваются в «замкнутой среде», проходя все стадии развития, завершающиеся гибелью клеток при истощении питательной среды.

I ЛАГ-фаза, II ЛОГ-фаза,III Стационарная фаза,IV Фаза гибели

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток.

Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.)

Культвирование аэробов.

Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факультативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода.

Культивирование анаэробов.

Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах —анаэростатах(откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной

раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Иногда посевы помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание С02.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Питательные среды для культивирования бактерий.

Питательные среды необходимы для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях.

Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

1.Должны содержать источники органогенов (азота, углерода, кислорода, водорода), факторы роста (аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, липиды,железопорфирины и пр.) и микроэлементы (калий, натрий, магний, кальций, сера, фосфор, железо,марганец, медь и пр.);

2.Должны быть изотоничны - содержать набор солей для поддержания осмотическогодавления;

3.Должны иметь оптимальный показатель рН (для большинства бактерий 7,2-7,6);

4.Должны иметь оптимальный окислительно-восстановительный (редокс) потенциал - высокий для аэробов, низкий для анаэробов;

5.Большинство сред должны быть прозрачны (чтобы был виден рост бактерий);

6.Должны быть стерильны.

Питательные среды готовят на основе мясных отваров (причем, используется только мякоть – без жира, костей и сухожилий), пептонов (продуктов гидролиза белков – смесь олиго- полипептидов и до 30% аминокислот), полученных промышленным путем гидролизатов из рыбыи мяса (в виде сухих полуфабрикатов или паст)

Для придания плотности питательным средам в них добавляют агар-агар (полисахариды, полученные из морских водорослей). Существуют готовые сухие среды определенного состава.

Классификация сред.

По происхождению среды подразделяют на естественные (природные или натуральные), искусственные и синтетические.

Естественные среды могут состоять из компонентов животного (например, кровь, сыворотка, молоко) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

Искусственные среды изготовлены по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

Синтетические среды – содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По консистенцииции среды бывают жидкие(бульоны) полужидкие(менее 1% агара) , плотные(2%агар), сыпучие(для длительного хранения культур), сухие.

По составу среды делят на простые: 1%-ная пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера; и сложные: сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар и пр.

По назначению среды подразделяют на основные – на которых культивируют большинство микроорганизмов (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон и пр.), и специальные –используемые для различных целей; среди них выделяют:

элективные – среды, на которых растут определенные группы или виды микроорганизмов в результате подавления сопутствующей микрофлоры (солевой агар для стафилококков): содержат различные ингибиторы роста микробов (соли желчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит K⁺; антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый и др.), имеют иныепоказатели рН, особый состав питательных веществ в среде и др.

среды обогащения – используются для накопления «прихотливых» микроорганизмов или микроорганизмов, присутствующих в патологическом материале в небольших количествах сывороточный бульонили свернутая сыворотка для дифтерийной палочки)

дифференциально-диагностические – самая большая группа сред; используются для выявления определенных свойств микроорганизмов с целью идентификации. В состав этих сред, кроме питательных веществ, обычно включают субстрат, по отношению к которому дифференцируются бактерии, и индикатор. Если микроб ферментирует субстрат, входящий в состав среды, то сдвигается рН среды, и изменяется цвет индикатора (среда Эндос лактозой для выявления лактозоположительных бактерий, среды Гисса с углеводами для выявления сахаролитических свойств бактерий и пр.)

консервирующие (среды для хранения), транспортные – среды, используемые для транспортировки патологического материала, содержащего «прихотливые» микроорганизмы; для кратковременного или долгосрочного хранения чистых культур микроорганизмов.

селективные – среды, используемые для выявления среди бактерий одного вида особей с измененными свойствами (устойчивость к антибиотикам, способность утилизировать субстрат); Т.е. в этой среде созданы условия для выращивания одного вида микробов.

эти среды содержат компонент, в отношении которого выявляются изменения, и в случае с субстратами – индикатор, позволяющий обнаружить колонии изменившихся бактерий.

Большинство питательных сред специального назначения обладают свойствамикак элективными, так и дифференциально-диагностическими:

среда Плоскирева содержит соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый – как факторы, подавляющие рост кишечной палочки, и тем самым способствующие росту сальмонелл и шигелл; а также лактозу и индикатор, позволяющие отличить шигеллы и сальмонеллы (лактозоотрицательные) от колоний кишечной палочки (лактозоположительной);

желточно-солевой агар – являясь элективной средой для стафилококков (по причине повышенного содержания хлорида натрия), одновременно позволяет выявить у них лецитиназную активность – способность расщеплять лецитин, входящий в среду в составе яичного желтка.