1. Методы культивирования фагов, их титрование. Применение бактериофагов в микробиологии и медицине.

Культивирование фагов

Фаги культивируют на чувствительных культурах бактерий. На жидких питательных средах получают фаголизаты. На плотных средах можно получить негативные колонии, или бляшки. Из изолированной бляшки можно получить чистую культуру бактериофага.

Методы обнаружения и титрования фагов

Метод стекающей капли. На газон чувствительной культуры наносят каплю фаголизата. Посевы культивируют сутки. По ходу стекающей капли наблюдают зону лизиса бактериальной культуры.

Титрование фагов в жидкой питательной среде по Аппельману. В жидкой питательной среде делают серийные десятикратные разведения фаголизата (с первого по десятое разведение). В каждую пробирку добавляют по 0,1 мл чувствительной тест-культуры бактерий, посевы помещают на сутки в термостат. В качестве контроля используют культуру бактерий без фага. Определяют титр бактериофага – самое большое разведение фага, при котором наблюдается лизис тест-культуры бактерий.

Титрование фагов на плотной питательной среде по Грациа. Делают серийные десятикратные разведения фаголизата в физ.растворе. В пробирку с 5мл расплавленного и остуженного агара добавляют 1 мл соответствующего разведения фаголизата и 0,1 мл чувствительной тест-культуры бактерий. Эту смесь верхним слоев выливают на чашку Петри с агаром. Посевы помещают в термостат, через сутки на газоне бактериальной культуры появляются негативные колонии бактериофага. Это методика точная, так как позволяет определить количество фага в фаголизате с точностью до одной фаговой частицы.

Применение фагов в медицине

Бактериофаги делят диагностические и лечебно-профилактические.

Диагностические фаги используют:

1. Для идентификации культур бактерий

2. Для типирования культур бактерий с целью определения источника инфекции и путей ее распространения (используют типовые наборы фагов).

3. Для индикации возбудителя (есть фаг, следовательно, есть и возбудитель).

Лечебно-профилактические фаги:

1. Для профилактики инфекционных заболеваний в очагах инфекции

2. Для комплексного лечения инфекционных заболеваний

Производят брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый фаги и комбинированные препараты.

Способы введения фагов в организм человека: местно, энтерально и реже парентерально.

Фаги используют ограниченно для лечения инфекционных заболеваний, так как не все штаммы возбудителей будут чувствительны к фагам. Фаги не позволяют полностью очистить организм от возбудителя, но способнысущественно снизить дозу возбудителя.

Умеренные фаги используют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.

2. Антибиотики. История открытия. Классификации антибиотиков по способам получения, по происхождению, по химическому строению, механизму действия, спектру антимикробного действия. Бактерицидное и бактериостатическое действие антибиотиков. Еденицы измерения антимикробной активности антибиотиков

Эре антибиотикотерапии предшествовал период разработки антимикробных химиопрепаратов.

Некоторые вехи:

1. в 1891г. Д.А.Романовский сформулировал основные принципы химиотерапииинфекционных болезней, предложил хинин для лечения малярии,

2. П.Эрлих в 1906г. предложил принцип химической вариации. Синтезированы производные мышьяка сальварсан и неосальварсан, предложен химиотерапевтический индекс.

3. Круг химиопрепаратов постепенно расширялся. В 1932г. открыты подходы к созданию сульфаниламидных препаратов. В 1935 Домаг открыл красный, белый стрептоцид. Однако поистине революционное значение имело открытие антибиотиков.

4. В России в 1870-х годах Полотебнов и Манассеин наблюдали лечебный эффект при прикладывании зеленой плесени к ранам

5. Ермольева в 1942 году в бомбоубежище обнаружила зеленую плесень и спасла несколько раненных от ампутации конечностей, лечение было более эффективным, чем сульфаниламидами.

Одним из универсальных механизмов антогонизма микроорганизмов является синтез антибиотиков, которые тормозят рост и размножение микроорганизмов (бактериостатическое действие) или убивают их (бактерицидное действие). Антибиотики- вещества, которые могут быть получены из микроорганизмов, растений, животных тканей и синтетическим путем, обладающие выраженной биологической активностью в отношении микроорганизмов.

Таких веществ известно несколько тысяч, однако реально используют значительно меньше. Существует ряд требований к антибиотикам, существенно ограничивающих их терапевтическое применение:

- эффективность в низких концентрациях;

- стабильность в организме и в различных условиях хранения;

- низкая токсичность или ее отсутствие;

- выраженный бактериостатический и (или) бактерицидный эффект;

- отсутствие выраженных побочных эффектов;

- отсутствие иммунодепрессивного воздействия.

Первыми открытыми антибиотиками были пенициллин(из зеленой плесени) (Флеминг) и стрептомицин (Ваксман).

Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия.

По способам и источнику получения:

- природные(продуцируемые микроорганизмами) , полусинтетические (получены в результате модификации структуры природных – пеницилины, цефалоспорины, тетрациклины) и синтетические(полностью синтезированный аналог – фторхинолон и др.)

- органические и неорганические

- соли тяжелых Ме – ртутьсодержащие, висмутсодержащие, препараты серебра и т.д.

- алколоиды – хинин, ипекакуаны

- мышьяковские препараты - осорсол, новарсенол

По происхождению антибиотики могут быть:

- бактериального (полимиксин, грамицидин);

-актиномицетного: аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин), макролиды эритромицин, олеандомицмин), тетрациклины, полиеновые антибиотики (нистатин, леворин), карбапенемы (меропенем, имипенем)

- грибкового (пенициллин);

- растительного (рафанин, фитонциды);

- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).

Больше всего известно антибиотиков актиномицетного происхождения. Актиномицеты- преимущественно почвенные микроорганизмы. В условиях большого количества и разнообразия почвенных микроорганизмов их антогонизм, в том числе с помощью выработки антибиотиков- один из механизмов их выживания.

По химической структуре :

- гликолепиды – ванкомицин (крупные молекулы, которым трудно пройти через поры Гр- бактерии)

- бета –лактамы – содержат бета-лактамное кольцо при утрате которого препараты теряют свою активность (бактерицидный механизм д-я) – пенициллинцы, цефалоспорины, карбонемы идр

- макролиды – эритромицин (макроциклическое лактамное кольцо) – бактериостат. Эф-т

- аминогликозиды (аминосахариды, соединенные гликозидной связью) - гентамицин гексоза + радикал)

- полиеновые противогрибковые – нистатин, леворин. Нарушают проницаемость ЦПМ.

- тетрациклины (содержат 4 бензольных кольца, действующих на рибосому прокариот)

По спектру действия антибиотики разделяют на:

- действующие преимущественно на грамм+ микрофлору- пенициллин, эритромицин;

- действующие преимущественно на грамотриц. микрофлору- полимиксин;

- широкого спектра действия ( на грам-плюс и грам-минус флору)- стрептомицин,

- противогрибковые- нистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;

- противотуберкулезные- стрептомицин, канамицин;

- противоопухолевые- рифампицин;

- противовирусные- интерферон, зовиракс, ацикловир.

Антибиотики разделяют по механизму действия:

- ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на L- формы, покоящиеся формы бактерий;

- ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);

- ингибиторы синтеза НК, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);

- ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).

- ингибиторы репликации и транскрипции (фторхинолоны)

- ингибиторы синтеза ДНК – противоопухолевые препараты , фторхинолоны, ципро- и левофлоксацин.