2. Материалы и методы

   1. Регистрация спектров флуоресценции пигментов. Лист растения разделяется на 3 части: 1-ая часть исследуется в целом виде, из 2-ой части готовится водный гомогенат, а из 3-ей – ацетоновый экстракт.

Далее проводится регистрация спектров флуоресценции растительных пигментов в трех образцах:

- целом листе (кусок листа располагается в кювете по диагонали, 60° к направлению возбуждающего луча)

- водном гомогенате (в кювету добавляется 2 мл, раствор не густо окрашен, слегка зеленый)

- ацетоновом экстракте (в кювету добавляется 2 мл).

Условия регистрации спектров: длина волны возбуждения — 430 нм, диапазон сканирования — 600-800 нм, скорость сканирования — 6 нм/с, высокое напряжение на ФЭУ выбирается исходя из уровня сигнала на длине волны 680 нм.

2. Проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации. Спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте измеряются несколько раз (разведенный экстракт в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза). Для этого из кюветы забирается 1 мл исходного экстракта и добавляется 1 мл ацетона. Перемешайте содержимое кюветы перемешивается и измеряется спектр (условия аналогичные п. 2.1). Повторив данную манипуляцию еще 5 раз, получаем спектры разведений 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и 1/64.

3. Результаты

   1. Спектры люминесценции растений были зарегистрированы в 3-х средах: целом листе, водном гомогенате, ацетоновом экстракте. Нормирование экспериментальных данных проводилось путем деления значения интенсивности для каждой длины волны на максимально высокое значение из всего ряда данных.

Полученные спектры приведены ниже (график 1).

График 1. Нормированные спектры люминесценции пигментов в 3-средах.

2. Было произведено 6 последовательных разведений, в ходе чего получено 7 растворов различных концентраций (базовый раствор и разведенные в 2, 4, 8, 16, 32, 64 раза).

График 2. Ненормированные спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте при различных разведениях (от разведения 1:1 до 1:64 в количественных долях).

3. Аналогично п.3.1 были определены максимальные значения интенсивности люминесценции, но уже для ацетонового экстракта и построен график зависимости этой характеристики от концентрации вещества

График 3. Зависимость максимальной интенсивности люминесценции ацетонового экстракта от концентрации Imax(C) (концентрация выражена в долях от единицы).

№	Образец	Длина волны max, нм	Imax, отн.ед
1	Целый лист	685	3.3738
2	Водный гомогенат	682	1.473160
3	Ацетоновый экстракт (1:1)	671	21.0512
4	Ацетоновый экстракт (1:2)	669	16.2299
5	Ацетоновый экстракт (1:4)	669	11.2111
6	Ацетоновый экстракт (1:8)	668	7.09001
7	Ацетоновый экстракт (1:16)	669	3.60642
8	Ацетоновый экстракт (1:32)	668	2.23535
9	Ацетоновый экстракт (1:64)	667	1.27736

Таблица 1. Параметры измеренных спектров люминесценции.

	Длина волны max, см	Волновое число (см-1)
Целый лист	0.0000685	91722.62774
Водный гомогенат	0.0000682	92126.09971
Ацетоновый экстракт (1:1)	0.0000671	93636.36364
Ацетоновый экстракт (1:2)	0.0000669	93916.29297
Ацетоновый экстракт (1:4)	0.0000669	93916.29297
Ацетоновый экстракт (1:8)	0.0000668	94056.88623
Ацетоновый экстракт (1:16)	0.0000669	93916.29297
Ацетоновый экстракт (1:32)	0.0000668	94056.88623
Ацетоновый экстракт (1:64)	0.0000667	94197.90105

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте мы наблюдали спектры пигментов хлорофиллов — они флуоресцируют в красной области (625-740). Предположительно в эксперименте участвовали следующие разновидности хлорофиллов: хлорофилл а (I_max при длине волны 668 нм — экспериментальное значение приблизительно совпало с табличным, результат на 1 нм больше). Небольшое отклонение этой величины от табличного значения может быть связано с присутствием в растворе посторонних примесей, способных немного сдвигать спектр.

2. Максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту смещается в сторону более коротких волн. Ацетон – неполярный растворитель, который практически полностью удаляет пигменты из полярного окружения хлоропласта.

Отсутствие полярных взаимодействий приводит к изменению конформации молекул пигмента и более сильному смещению максимума флуоресценции в сторону более коротких волн. Кроме того, на данный процесс влияет денатурация и повреждение клеточных стенок.

3. Максимум флуоресценции пигментов в ацетоновом экстракте при уменьшении концентрации смещается, что можно связать с уменьшением оптической плотности растворов.

4. Линейность зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации выполняется частично. При меньших разведениях линейная зависимость не выполняется из-за внутреннего фильтра.