2. Титрування вірусів.

У лабораторних роботах з вірусами, біофармакологічному виробництві та у медичній і ветеринарній практиці виникає необхідність визначення кількості вірусів у потенційно вірусовмісному матеріалі. Кількість вірусу в будь-якому матеріалі визначають за титром вірусу в цьому матеріалі.

Титр вірусу – це кількість вірусу, яка міститься в одиниці об’єму матеріалу; інакше кажучи – концентрація вірусних часток у матеріалі. Віруси проявляють інфекційну і гемаглютинуючу дії. Саме тому визначають інфекційний та гемаглютинувальний вірусні титри.

Оскільки чутливість біологічних систем до вірусів (навіть високовірулентних штамів) коливається в широких межах, інфекційний титр у переважній більшості випадків можна визначити Як статистичну величину. За одиницю інфекційного титру прийнята 50%-ва ефективна доза – ЕД₅₀. Це така доза вірусу, яка спричинює інфекційний ефект у 50% заражених біологічних систем. Залежно від виду тест-об'єкта і форми прояву інфекційної дії вірусу ЕД₅₀ називається по-різному в кожному конкретному випадку.

Для визначення ЕД₅₀ готують ряд послідовних 10-разових розведень вірусу на 0,9%-му розчині NaCl, розчині Хенкса або середовищі для культури клітин (залежно від виду тест-об'єкта). У кінцевих розведеннях інфекційна дія вірусу не повинна проявлятися.

Кожним розведенням вірусу в однаковому об'ємі заражають рівну кількість чутливих тест-об'єктів (не менше 4). Спостерігають упродовж 5-12 діб, враховують результати дії вірусу (загибель, клінічні ознаки, патологоанатомічні зміни чи ЦПД). Розведення вірусу, яке зумовлює 50%-й інфекційний ефект, розраховують статистичними методами, найчастіше за методом Ріда і Менча. Потім визначають, скільки ЕД₅₀ містить такий самий об'єм нерозведеного вірусу та перераховують кількість ЕД₅₀ на 1 см³ вірусовмісного матеріалу, що і буде показником титру вірусу.

Розрахунок ЕД₅₀ за методом Ріда і Менча по ґрунтується на інтерполяції фактичних результатів титрування й отриманні кумулятивних даних. Це дає змогу штучно збільшити кількість тест-об'єктів і відповідно зменшити погрішність розрахунку ЛД₅₀.

Визначення інфекційного титру вірусів у БТО і ВТО.

Інфекційну активність вірусів можна оцінити за одиничним ефектом — появі в тест-об'єктів локальних уражень, а саме: утворення бляшок у культурі клітин і віспин на ХАО курячого ембріона. Відповідно інфекційний титр вірусів визначають у бляшкотвірних одиницях (БТО) і віспотвірних одиницях (ВТО). 1 БТО — це доза вірусу, яка спричинює утворення однієї бляшки в культурі клітин. 1 ВТО - це доза вірусу, яка спричинює утворення однієї віспини на ХАО курячого ембріона.

Для визначення інфекційного титру вірусу в БТО або ВТО певним розведенням вірусовмісного матеріалу в однаковому об'ємі заражають кілька матраців із культурою клітин або курячих ембріонів на ХАО. Через відповідний час підраховують кількість бляшок або віспин. Титр вірусу визначають за формулою: , де n – середнє арифметичне кількості бляшок на один матрац або віспин на один курячий ембріон; V – об’єм вірусу; а – розведення вірусу.

У РГА визначають гемаглютинувальний титр вірусу. Для цього готують дворазові розведення вірусу на 0,9%-му розчині NaCl в однаковому об'ємі (0,2 см3, 0,05 см3 або 0,025 см3). До кожного розведення вірусу додають такий самий об’єм 1%-ї суспензії еритроцитів певного виду. В останню лунку вірус не вносять, а залишають для контролю еритроцитів на спонтанну гемаглютинацію.

Планшети струшують і витримують певний час при відповідній температурі (4°C, 18 - 22°С або 37°С) залежно від виду. Найчастіше експозиція становить 60 хв за кімнатної температури. Результати реакції оцінюють в плюсах після повного осідання еритроцитів у контрольній лунці.

++++ - всі еритроцити аглютиновані; утворився суцільний шар у вигляді «парасольки» з опалими краями.

+++ - всі еритроцити аглютиновані; утворився суцільний шар у вигляді «парасольки» з рівними краями.

++ - більшість еритроцитів аглютинована; утворилась «парасолька», по краях якої відмічається тонке кільце з неаглютинованих еритроцитів.

+ - більшість еритроцитів не аглютинована; утворився осад у вигляді «ґудзика», по краях якого незначна «парасолька».

• - всі еритроцити не аглютиновані; утворився осад у вигляді «ґудзика» з рівними краями.

За одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО) приймають найбільше розведення вірусу, яке спричинює чітко виражену гемаглютинацію (не менше ніж на 2 плюси). Кількість ГАО в нерозведеному вірусовмісному матеріалі виражає титр вірусу.

Показником гемаглютинувального титру вірусу є число, обернено пропорціональне його розведенню. Наприклад, якщо 1 ГАО міститься в розведенні вірусу 1:128, то його титр становить 128 ГАО. При позначенні гемаглютинувального титру об'єм вірусовмісного матеріалу можна не вказувати, оскільки об'єм титрування не має істотного впливу на результати РГА (завжди змішують рівні об'єми вірусу та 1%-ї суспензії еритроцитів).