Методы изучения первичной структуры

1. Методы метки N-концевых и С-концевых аминокислот.

а) Метод метки N-концевых аминокислот динитрофторбензолом. Был предложен Сенджером.

Сенджер с помощью этого метода определил последовательность инсулина.

Метод имеет существенный недостаток: чтобы выделить меченый аминокислотный остаток, нужно белок гидролизовать до отдельных аминокислот. Т.е. с помощью этого метода можно определить только одну N-концевую аминокислоту.

Следующий метод более прогрессивный.

б) Дансилхлоридный метод. Достоинство: образуется интенсивно флуоресцирующее соединение, поэтому можно работать с нанограммами белка. Метод высокочувствительный. (Если в ведро воды капнуть 1 каплю крови, то можно определить одну N-концевую аминокислоту). Недостаток тот же: требуется гидролиз, определяется только одна N-концевая аминокислота.

в) Метод Эдмана (фенилтиогидантоиновый). Этот метод работает сейчас.

Для метки N-концевой аминокислоты используется фенилизотиоцианат. Он связывается с первой N-концевой аминокислотой. N-концевая аминокислота отделяется. При выделении метки белок сохраняет целостность.

Метод Эдмана более прогрессивен. Достоинство: позволяет последовательно определять N-концевые аминокислотные остатки, полипептид сохраняет свою целостность. Так последовательно можно определить до 50–60 аминокислотных остатков (т.е. последовательность белка инсулина можно прочитать за 1 цикл работы).

Метод Эдмана используется в специальных приборах – секвенаторах.

Методы метки С-конца разбирать не будем.

А если белок состоит из 200 аминокислотных остатков, или больше? Тогда используют вторую группу методов.

2. Селективный гидролиз

(девиз английских колонизаторов: разделяй и властвуй). Используются ферменты – протеазы, которые гидролизуют белки по пептидным связям. Но не по всем пептидным связям, а образованным с участием определенных аминокислотных остатков. При действии таких протеаз образуются не отдельные аминокислоты, а пептиды.

Например, гидролиз проходит только по лизину. Если в белке имеется только 1 лизин, то образуется 2 пептида, если имеется 2 лизина, то получится 3 пептида и т.д.

Познакомимся с протеазами.

Белок продолжается в обе стороны (это показывают особой стрелкой, начинающейся ломаной линией). Каждый аминокислотный остаток участвует в образовании двух пептидных связей. Эта рабочая схема помогает понять принцип работы протеаз и какие продукты образуются в результате гидролиза.

Разберём механизмы работы протеаз по радикалам R₁ и R₂.

Если протеаза работает по механизму R₁, то она будет разрывать белок справа от радикала R₁, значит в разрываемую связь аминокислотный остаток с радикалом R₁ будет отдавать карбонильную группу СО (карбоксильную группу –СООН).

Если протеаза работает по механизму R₂, то она будет разрывать белок слева от радикала R₂, значит в разрываемую связь аминокислотный остаток с радикалом R₂ будет отдавать аминогруппу –NН₂.

Приведём примеры протеаз.

Трипсин (фермент желудочно-кишечного тракта) работает по радикалу R₁, гидролизует белки там, где в аминокислотной последовательности стоят лизин и аргинин.

Химотрипсин работает по радикалу R₁, разрывает пептидные связи по фенилаланину, тирозину, триптофану.

Пепсин работает по радикалу R₂ и узнаёт следующие аминокислоты: фенилаланин, триптофан, глютаминовая кислота, лейцин.

Есть химические обработки, например, веществом бромциан. Это соединение работает по механизму R₁ и гидролизует по метионину.

Как работает селективный гидролиз и как удается воссоздать первичную структуру?

Принцип метода заключается в том, что крупные белки с помощью протеаз разделяются на короткие пептиды Белок гидролизуется протеазой. После первого гидролиза выделяются пептиды, определяются N- и С-концевые аминокислоты, затем в каждом пептиде определяется последовательность аминокислот. Теперь необходимо определить порядок пептидов в белке. Для этого специфически подбираются несколько протеаз:

Вторая протеаза подбирается так, чтобы получившиеся пептиды имели перекрывающиеся участки (были длиннее предыдущих). Анализируя полученные результаты, воссоздают порядок пептидов в белке и его первичную структуру.

Проводится ряд обработок протеазами. Каждый вид обработки приводит к своему набору пептидов.

1. Каждая смесь пептидов разделяется на индивидуальные пептиды хроматографически и методом электрофореза.

2. Определяют состав и последовательность аминокислот каждого из выделенных пептидов.

3. Выявляют перекрывающиеся последовательности и воссоздают исходные.

Изучение первичной структуры.

Многие белки бактерий и высших организмов очень похожи друг на друга по пространственной структуре, и процессы метаболизма идут одинаково. Посмотрим на некоторые белки в эволюционном отношении.

Эволюционно далёкие организмы иногда имеют одинаковые белки. Мутации оказывают серьёзное влияние на функциональную активность белков.

Цитохром С состоит из 104 аминокислотных остатков. Это один из важнейших белков митохондрий. Его первичная структура изучена у десятков организмов. Он появился у прокариот 1,5 млрд лет назад. Это компонент дыхательной цепи. За это время его пространственная структура мало меняется у разных организмов. Выяснилось, что 35 аминокислот в последовательности этого белка вообще не изменились за1,5 млрд лет, по-видимому, они расположены в очень важных местах (окружают активный центр и отвечают за связывание цитохрома С с другими компонентами дыхательной цепи). Однако остальные изменились, но при этом пространственная структура осталась практически неизменной. Например, у лошади и дрожжей цитохром С различается по 48 аминокислотным остаткам, третичная структура почти не меняется. Почему это происходит, Вы поймете при изучении третичной структуры.

Естественный отбор допускает замены равнозначные, консервативные, внутри одного класса аминокислот, и почти не пропускает замены аминокислот между разными классами. Лейцин может заменяться на валин, такую замену отбор пропускает, глютаминовая кислота может заменяться на аспарагиновую кислоту. А между классами – замены не пропускает и такие замены называются радикальными.

Один из важных таксономических критериев вида – биохимический, используется в систематике наряду с другими.

Например, у таких далеких в филогенетическом отношении видов как лошадь и дрожжи цитохром С различается по 48 аминокислотным остаткам, а у утки и курицы – отличается на 2 аминокислотных остатка.

У индейки и курицы цитохром идентичен. Также идентичен у свиньи коровы и овцы. Почему?

Некоторые белки очень консервативны по своей структуре. Так, гистон 4, состоящий из102 аминокислот, у гороха и коровы имеет всего две замены – лиз на арг и иле на вал– обе консервативны. Почему естественный отбор пропускает только консервативные замены? Ответить самостоятельно.

Ещё один пример – появление мутантного аллеля гемоглобина HbS (нормальный гемоглобин – HbA). При этом произошла всего одна мутация, в результате которой в белке гемоглобине заряженная аминокислота (глу) поменялась на гидрофобную аминокислоту (вал) в шестом положении β-цепи гемоглобина (радикальная замена).Эта мутация приводит к тяжёлому заболеванию – серповидно-клеточной анемии. При этой болезни молекулы гемоглобина слипаются, образуя длинные псевдокристаллы вытянутой формы, как следствие эритроциты вытягиваются, приобретая серповидную форму. Они плохо проходят через капилляры и рвутся. Почему эта мутация не была элиминирована естественным отбором? Потому что её носители имеют преимущество – малярийный плазмодий не поражает такие эритроциты.

Распространение аллеля серповидноклеточной анемии (более тёмная окраска – большая частота встречаемости, наибольшая частота - около 15%)

Серповидный эритроцит