74. Методы с использованием конъюгированных иммуноглобулинов – реакция иммунофлюресценции , ифа, риа, иммуноблотинг.

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса).Различают разновидности метода прямой, непрямой. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом

Иммуноферментный анализ – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.

Радиоиммунныйанализ (РИА)— метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Иммуноблоттинг (вестернблоттинг) – высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Суть этого метода, применяемого для идентификации белков, заключается в следующем. Содержащие белки суспензии подвергают электрофорезу в соответствующем геле. Затем на гелевую пластинку накладывают пластинку из сорбирующего пористого материала (чаще всего целлюлозный или нитроцеллюлозный фильтр) и создают условия для переноса на нее белков из геля. В силу того, что перенос происходит за счет естественной или усиленной тем или иным способом диффузии в направлении гель-фильтр, расположение мест сорбции белков на фильтре будет соответствовать их расположению в геле после фореза. Фактически такой перенос на фильтр необходим для улучшения условий обработки анализируемых белков мечеными антителами. Mанипулируя с фильтром, легче создать условия для взаимодействия антиген-антитело, легче отмывать от несвязавшихся антител и, главное, легче визуализировать результаты. В зависимости от желания и возможностей исследователя можно применить любой современный вариант визуализации – РИФ, ИФА или РИА.