69. Методы биологических исследований, основанные на использовании антител.

3.1. Иммуноферментный анализ (ИФА). Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген-антитело с измеряемой ферментной меткой. Антигены или антитела, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субтрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело.

3.2. Радиоиммунный анализ (РИА). Этот высокочувствительный метод разработан в 1960 г., он является предшественником иммуноферментного анализа. Принципы этих методов аналогичны, но в радиоиммунном анализе используется радиоактивная метка. Для определения иммуноглобулинов используется мало, и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

3.3. Иммунофлюоресцентный анализ. Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

Иммуноблоттинг — качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем — с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.