50. Иммуноэлектрофорез, его основные разновидности.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) – метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Это самый эффективный метод подтверждения наличия в сыворотке или моче парапротеина и идентификации типа легких и тяжелых цепей. ИЭФ помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутствуют и другие антигены. С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов различных классов, идентифицируют миеломные белки. Также ИЭФ используется при диагностике иммунодефицитных состояний. Метод незаменим в последовательном наблюдении за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов. ИЭФ позволяет диагностировать гипогаммаглобулинемию и агаммаглобулинемию, которая чаще всего связана с наследственной патологией и проявляется уже в раннем детстве (синдром Вискотт-Алдриха, болезнь Брутона, атаксия).

Виды иммуноэлектрофореза

А- простой иммуноэлектрофорез;

Б- встречный иммуноэлектрофорез;

В - ракетный иммуноэлектрофорез;

Г - двумерный иммуноэлектрофорез.

Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков (антигенов) в забуференном геле агара; после снятия напряжения вдоль направления движения белков в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

Встречный иммуноэлектрофорез может применяться для определения антигенов, мигрирующих в агаре к положительно заряженному электроду. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Aspergillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе.

Ракетный электрофорез – это количественный метод, предусматривающий внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты, длина которой определяется концентрацией антигена. Как и встречный электрофорез, это быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному электроду.

Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза - двухмерный или перекрестный иммуноэлектрофорез. Используют для разделения сложной смеси. Метод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворачивают на 90^о и подвергают повторный разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом, удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси.

51. Методы иммунофлюоресценции.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции) – метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Существует 3 вида РИФ:

1) прямая иммунофлуоресценция (обработка анализируемого препарата антителами, связанными с флюорохромами; после отмывания препарата от антител его просматривают в люминесцентном микроскопе)

2) непрямая флуоресценция, включает 2 этапа:

- обработка обычными антителами;

- обработка конъюгированными с флюорохромом антителами, затем отмывают и микроскопируют. Разрешающая способность такой реакции выше, т. к. позволяет работать с очень разными антителами и на одно «несветящееся» антитело насаживается несколько «светящихся».

Недостатками реакций иммунофлюорисценции является невозможность их применения к объектам, молекулы которых могут флюорисцировать, и невысокая точность определения количеств анализируемых антигенов.

Механизм.

1. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя.

2. Для образования комплекса антиген–антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител.

3. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37°С

4. Затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия.

В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген–антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.