- •Легенды и мифы о фиксации и проводке ткани
- •Миф гистологической технологии: «стандартный метод»
- •Фиксация: Миф 1 Универсальный фиксатор
- •Химик, физик и патолог
- •История формальдегида как фиксатора в микротехнике
- •Формалин как фиксатор сегодня
- •Предварительно забуференный концентрат
- •Фиксация: Миф 2 Быстро фиксирующие жидкости
- •Фиксация: Миф 3 Время фиксации формалином - часы
- •Этапы фиксации формалином
- •Пропитывние фиксатором или проникновение фиксатора в ткань
- •Показатели проникновения и уровни связывания формальдегида
- •Фиксация: Миф 4 При нагревании формалин быстро фиксирует
- •Фиксация: Миф 5 Ускорение фиксации вакуумом
- •Диапазон фиксации и температура
- •Равновесное
- •Фиксация: Миф 6 Можно фиксировать в малом объеме формалина
- •Фиксация: Миф 7 Достаточно одной смены формалина
- •Этапы воздействия формалина на ткани
- •Что происходит при фиксации?
- •Преимущества формалина
- •Недостатки формалина
- •Недостатки любого заменителя формалина
- •Рекомендации комитета по ИГХ- тестированию рецепторов эстрогена
- •Проводка ткани: Миф 1 Достаточно 2-3 смены дегидратанта
- •Сколько смен дегидратанта необходимо?
- •Проводка ткани: Миф 2 Не важен тип дегидратанта
- •Выбор дегидратанта
- •Проводка ткани: Миф 3 Нагрев дегидратанта сокращает время проводки
- •Проводка ткани: Миф 4 Не важен тип просветлителя
- •Типы просветлителей
- •Просветлители: терпены (на базе d-лимонена) и растительные масла
- •Просветлители - алканы
- •Опасность ксилола
- •Механизмы циркуляции ксилола в организме человека
- •Репродуктивная токсичность ксилола (1)
- •Репродуктивная токсичность ксилола (2)
- •Признаки действия ксилола на организм человека (The Innovator, Vol. 4, №1, 2001)
- •Проводка ткани: Миф 5 Переход дегидратант - просветлитель не важен
- •Сравнение методов: ИПА-парафин и этанол-ксилол
- •Минеральное масло
- •Промежуточные смеси (изопропанол-минеральное масло)
- •Батареи для проводки с изопропанолом и минеральным маслом
- •Основные этапы проводки ткани (традиционная схема)
- •Схема проводки тканей (ручная) в реагентах Блик
- •Проводка ткани: Миф 6 При смене реагентов результаты проводки хуже
- •Полный цикл смены реагентов этанол - ксилол
- •Полный цикл смены реагентов изопропанол – минеральное масло
- •Принципы смены реагентов
- •Как рассчитать объем реагентов для закупки?
- •Сходство и отличие методов проводки
- •Расход реагентов на 1000 блоков этанол-ксилол
- •Расход реагентов на 1000 блоков в методе изопропанол-минеральное масло
- •Проводка ткани: Миф 7 Не важен тип парафина для проводки
- •Тепловой эффект микротомии
- •Сдавливание срезов при резке 1
- •Сдавливание срезов при резке 2
- •Диаграмма напряжений при резке
- •Обратимые и необратимые этапы приготовления гистопрепаратов
- •Возможна ли стандартизация гистологических методов?
- •Благодарю за внимание!
Типы просветлителей
Растительные
масла
Терпены и терпеноиды
Алканы
Высокая вязкость и плохая смешиваемость со спиртами. Большинство дороже ксилола
Вызывают аллергию, имеет цитрусовый запах, раздражает кожу. Содержат d-лимонен. Дороже ксилола
Низкий уровень опасности. Плохи для просветления и депарафинирования. Плохо смешиваются с этанолом.
Дешевле ксилола.
Всего на рынке продавалось порядка 57 торговых марок заменителей ксилола
Просветлители: терпены (на базе d-лимонена) и растительные масла
•AmeriClear
•CitriSolve-hybrid
•CitroClear
•CitroSolve
•CitraSolve
•CitriSolve
•Citrus Clearing Solvent
•Citrus Natural Solvent
•Clearene
•d-Limonene
•Histoclear
•Histolene
•Histoclear II
•Histolemon
•Histosolve X
•Bio-Clear
•K-Clear
•Master Clear Clearing Agent
•Pro-Clear
•Roti-Histol
•Safety-Solv
•Hemo-De
•Скипидар (живица), бергамотное, кедровое, гвоздичное, оригановое масла, терпинеол и масло чабреца
Просветлители - алканы
•Clear-advantage (нафтеновые)
•Clearify (нафтеновые)
•Clear-Rite 3 (алифатические)
•EMS (изопарафиновые)
•Envirene (нафтеновые)
•Formula 83 (нафтеновые)
•Isopar-L (нафтеновые)
•K-Clear Plus (изопарафиновые)
•Kerosene (изопарафиновые)
•MCS-2806 Process Fluid (нафтеновые)
•Microclear (изопарафиновые)
•Naphtha (нафтеновые)
•Neo-Clear (растворитель Stoddard)
•P-4 (изопарафиновые/нафтеновые)
•Paraclear (нафтеновые)
•Pro-Par (изопарафиновые + пропиленгликолевый эфир)
•Roticlear (нафтеновые)
•S1-Histo
(изопарафиновые/нафтеновые)
•S3-Histo
(изопарафиновые/нафтеновые)
•SafeClear (растворитель Stoddard)
•SafeClear II (растворитель Stoddard + нафтеновые + изопарафиновые)
•Shandon Xylene Substitute
(алифатические)
•ShellSol 15 (алифатические 85% + легкие ароматические 1% + этилбензол + 1,2,4 триметилбензол)
•ShellSol A 100 (нафтеновые)
•Slide Brite (алифатические)
•Slide Brite Elite (алифатические)
•Solvent 100 (легкие и тяжелые ароматические)
•Sub-X Xylene substitute (нафтеновые)
•Trican X.K.O. (ароматические и изопарафиновые 60-100% + ароматич. 5-10% + бензол <1%)
•UltraClear (изопарафиновые)
•Waxol (нафтеновые)
•White Spririts (растворитель Stoddard)
•XS-3 (нафтеновые)
•Xylene Substitute 2 (алифатические)
•Xyless II (нафтеновые)
•Минеральное масло (алифатические)
Опасность ксилола
Нейротоксичность Патология сердца, почек, лейкемии, эритремия, сухость кожи
Вторичные инфекции, сухость кожи, шелушение Истощение митохондриальной АТФ в поврежденных клетках
Острые токсические нарушения костного мозга и панцитопения Общие симптомы отравлений при работе с ксилолом от 1.5 до 18 лет Проникновение в грудное молоко Билатеральная слуховая нейропатия Эпителиальная и стромальная кератопатия
Механизмы циркуляции ксилола в организме человека
1 |
Легкие → жировая ткань |
Период |
полураспада |
||
|
|
ксилола в |
2 Кожа → подкожная жировая клетчатка |
жировой клетчатке |
|
1- 6 дней |
Маркер
Уровень метилгиппуровой кислоты и креатинина
(Не были предложены другие тесты для оценки детоксикационных функций печени и почек)
Репродуктивная токсичность ксилола (1)
Таблица 1: История беременностей женщин перед исследованием
|
Подвергавшие |
Контрольные |
|
История |
ся |
женщины |
|
женщины |
|||
|
(n=125) |
||
|
(n=125) |
||
|
|
||
Среднее число |
|
|
|
предыдущих |
1.98 |
1.94 |
|
беременностей у |
|||
|
|
||
женщин |
|
|
|
% женщин с |
|
|
|
предыдущими |
|
|
|
выкидышами во |
46.2% |
19.2% |
|
время работы с |
|
|
|
ксилолом |
|
|
Репродуктивная токсичность ксилола (2)
Таблица 2: Случаи изученных эмбриональных проблем |
|||
|
Обследуемая |
Контрольная |
|
Анамнез |
группа |
||
группа (n=125) |
|||
|
(n=125) |
||
|
|
||
Живые рождения |
113 |
115 |
|
Выкидыши и аборты |
12 |
10 |
|
Полные |
125 |
125 |
|
беременности |
|||
|
|
||
Крупные уродства |
13 |
1 |
|
Незначительные |
5 |
1 |
|
уродства |
|||
|
|
||
Дистресс плода |
17 |
6 |
|
Преждевременные |
9 |
3 |
|
роды |
|||
|
|
||
Средний вес дитя |
3.368 |
3.536 |
|
(кг) |
|||
|
|
Признаки действия ксилола на организм человека (The Innovator, Vol. 4, №1, 2001)
1. Нарушения неврологических функций
•Время реакции
•Ловкость рук
•Координация
•Баланс тела
•Способность учиться
2.Функции периферических нервов
3.Сонливость
4.Умственная и физическая усталость
5.Головные боли
6.Раздражительность
7.Колебание изменений/настроения личности
8.Уменьшение мотивации
Проводка ткани: Миф 5 Переход дегидратант - просветлитель не важен
Можно работать и без промежуточных смесей
В методе с ксилолом (хлороформом) обычно используется промежуточная смесь ксилол (хлороформ)/парафин 1:1 при 37оС. В методе с изопропанолом и парафином
(без просветлителя) очень многие лаборатории сталкиваются с неадекватными результатами и производители оборудования предлагают модификации расписаний проводки с нагревом парафина до 65-75оС.
Метод с изопропанолом и минеральным маслом без промежуточных смесей также будет не эффективным.
Сравнение методов: ИПА-парафин и этанол-ксилол
80 |
|
|
|
60 |
|
|
|
40 |
|
|
|
20 |
|
|
|
0 |
формалин |
изопропанол |
парафин |
|
|||
δ |
48 |
25 |
16 |
ε |
75 |
18 |
3 |
ν |
1,23 |
2,8 |
6,32 |
ρ |
1 |
0,79 |
0,89 |
t |
22 |
22 |
60 |
80 |
|
|
|
|
60 |
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
0 |
формалин |
этанол |
ксилол |
парафин |
δ |
48 |
27 |
18 |
16 |
ε |
75 |
25 |
2,4 |
3 |
ν |
1,23 |
1,52 |
0,74 |
6,32 |
ρ |
1 |
0,79 |
0,86 |
0,89 |
t |
22 |
22 |
22 |
60 |
|
|
Сравнение методов: |
|
|
|
|
|||||
ИПА-парафин |
и |
ИПА-минеральное масло |
|||||||||
80 |
|
|
|
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
70 |
|
|
|
|
|
|
|
60 |
|
|
|
60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
30 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
0 |
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
формалин |
изопропанол |
парафин |
0 |
форма |
ИПА |
Смесь Смесь |
масло |
параф |
|||
|
|
|
|
|
|||||||
δ |
48 |
25 |
16 |
|
лин |
|
I |
II |
|
ин |
|
ε |
75 |
18 |
3 |
δ |
48 |
25 |
23 |
22 |
15 |
16 |
|
75 |
18 |
15 |
13 |
2 |
3 |
||||||
ν |
1,23 |
2,8 |
6,32 |
ε |
|||||||
ν |
1,23 |
2,8 |
3,19 |
3,7 |
5,1 |
6,32 |
|||||
ρ |
1 |
0,79 |
0,89 |
||||||||
ρ |
1 |
0,79 |
0,79 |
0,8 |
0,88 |
0,89 |
|||||
t |
22 |
22 |
60 |
||||||||
t |
22 |
22 |
22 |
22 |
22 |
60 |