Раздел 2. Биологическая активность

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из трех методов:

– по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов;

– по снижению концентрации глюкозы в крови мышей;

– по судорожной реакции у мышей.

Метод определения биологической активности инсулина по снижению

концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Условия подготовки животных описаны в разделе 1 «Методика определения чувствительности кроликов к инсулину».

В опыт берут не менее 24 кроликов, которых распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора.

Непосредственно перед экспериментом из основного раствора СО, содержащего 100 МЕ/мл инсулина соответствующей видовой специфичности, готовят два рабочих раствора СО, используя в качестве растворителя раствор № 2 (примечание 3 к общей части). Рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО – 1,5 и 3,0 МЕ/мл. Из основного раствора ИП, учитывая его ожидаемую активность, аналогичным образом готовят рабочие растворы тех же концентраций.

Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,2 мл/кг (малая и большая доза СО – s₁ и s₂ соответственно), а третьей и четвертой – такой же объем рабочих растворов ИП (малая и большая доза ИП – u₁ и u₂ соответственно). Взятие крови из краевой вены уха проводят дважды: через 1 и 2,5 часа после инъекции, как описано в разделе 1. Вторую постановку (перекрест) проводят через неделю после первой. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл. 31.1).

Таблица 31.1

Схема двойного перекреста

	ГРУППА 1	ГРУППА 2	ГРУППА 3	ГРУППА 4
I ПОСТАНОВКА (день I)	s1	s2	u1	u2
II ПОСТАНОВКА (день II)	u2	u1	s2	s1

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов двойного перекреста (биологическая активность инсулина методом А и В)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению

концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Условия проведения опыта такие же, как при определении чувствительности (раздел 1). Введение рабочих растворов СО и ИП проводят по схеме двойного перекреста (табл. 31.1).

Непосредственно перед экспериментом из основного раствора СО, содержащего 100 МЕ/мл инсулина соответствующей видовой специфичности, готовят два рабочих раствора, используя в качестве растворителя раствор № 2 (примечание 3 к общей части). Малую и большую дозу инсулина выбирают в соответствии с предварительно определенной чувствительностью животных, как описано в разделе 1.

Аналогичным образом готовят рабочие растворы ИП, исходя из его ожидаемой активности.

Рекомендуемый диапазон концентраций рабочих растворов СО и ИП находится в пределах 0,06–0,35 МЕ/мл.

Согласно схеме двойного перекреста (табл. 31.1), первой и второй группе мышей подкожно вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП. Взятие крови проводят согласно разделу 1. Вторую постановку (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов двойного перекреста (биологическая активность инсулина методом А и В)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по

судорожной реакции у мышей (метод С)

В опыт берут 96 мышей. Животных лишают корма за 18–20 часов до начала опыта и распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора.

Непосредственно перед экспериментом готовят два рабочих раствора ИП и два рабочих раствора СО соответствующей видовой специфичности, используя в качестве растворителя раствор № 2. Рекомендуемые концентрации рабочих растворов – 0,04 и 0,08 МЕ/мл (0,8 и 1,6 МЕ/кг).

Первой и второй группе мышей подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,2 мл/10 г, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП. Животных сразу после инъекции помещают в термостатируемую камеру с температурой 33–37 С и принудительной вентиляцией. Через 30, 60 и 90 мин проводят учет:

– погибших мышей;

– мышей, у которых наблюдалась судорожная реакция (животные в этом состоянии не держатся на наклонной сетке камеры или, будучи перевернутыми на спину, не могут повернуться и встать на лапы в течение 2–3 секунд).

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов упрощенным пробит-методом (определение биологической активности инсулина методом С)» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».