изучить влияние препарата на липолитическую активность (липопротеинлипазу) крови, поскольку последняя стимулирует гидролиз ЛП, богатых ТГ. Для этих целей используются крысы-самцы (200–250 г) или кролики-самцы (2,5–3 кг), которым предварительно перорально вводится изучаемое соединение (однократно или в течение недели), затем внутривенно гепарин (20–50 ед/кг массы тела). Берут исходную пробу крови и пробу через 10 мин после введения гепарина. В этих пробах крови определяют активность липопротеинлипазы (постгепариновую липолитическую активность крови). В контрольных исследованиях вводится равный объем растворителя изучаемого вещества.
1.4.7. Характеристики механизма гиполипидемического действия
Дляхарактеристикимеханизмагиполипидемическогодействияновогосоединенияисследуется по возможности его влияние на ключевой фермент биосинтеза ХС β-гидрокси- β-метилглутарил-коэнзим-А-редуктазу, а также на 7-a-холестерингидроксилазу, с использованием соответствующих методик, описанных в литературе и тест-систем.
1.4.8. Изучение влияния нового соединения на экскрецию желчных кислот и холестерина
При исследовании механизма гиполипидемического действия нового вещества со способностью к связыванию желчных кислот в кишечнике (как это наблюдается при применении официнальных желчных секвестрантов) необходимо проведение исследований на крысах, морских свинках или кроликах.
С этой целью животные помещаются на диету (на 2–3 недели), содержащую ХС (3%), холевую кислоту (0,5%) и растительное масло, предварительно прогретое при высокой температуре в течение 5 ч и охлажденное, как описано выше. В конце исследования, после 14–18 ч голодания, животным под наркозом катетеризируют желчный проток, осуществляют забор желчи в течение 15 мин, рассчитывают скорость экскреции желчи. В полученной желчи анализируют содержание холевой, дезоксихолевой, хенодезоксихолевой кислот, холестерина, рассчитывают индекс литогенности.
1.4.9. Исследование действия новых веществ, не обладающих гиполипидемическим действием,
но оказывающих антиатеросклеротический эффект
В исследованиях на кроликах, получавших ХС и исследуемое вещество, определяется проницаемость аорты. Для этих целей за 1–2 ч до эвтаназии животных им внутривенно вводится краситель (синяя краска Эванса 0,5% раствор, 2 мл) и после извлечения аорты планиметрически определяется площадь окрашивания эндотелия. В контрольных исследованиях вводится растворитель изучаемого вещества.
1.4.10. Изучение сосудистого действия
Пролиферация и миграция активированных гладкомышечных клеток артерий в метаболически и морфологически нарушенные участки артериальной стенки — как следствие влияния факторов риска развития атеросклероза, является завершающим этапом образования атеросклеротической бляшки. Поэтому для выяснения возможного сосудистого действия изучаемого соединения проводят иммуногистохимическое исследование маркеров пролиферации (Ki67), ангиогенеза (CD31(PECAM-1)), про- и антиапоптотических факторов (р53 и Mcl-1) и др. Гистологически оценивают соотношение числа эндотелиоцитов и перицитов в сосудистой стенке.
1.4.11. Исследование противовоспалительной активности
Учитывая существенную роль в атерогенезе воспалительного процесса артериальной стенки, для характеристики нового вещества с выявленной антиатеросклеротической
активностью желательно исследовать его противовоспалительную активность. Для этих целей используют методы иммуноферментного анализа для оценки в гомогенатах сосудов провоспалительных цитокинов (например, TNF-α), а также гистологический и иммуногистохимический анализ сосудистой стенки.
Заключение
Таким образом, перечисленный комплекс методов позволяет выявить специфическую активность нового соединения, в определенной степени выяснить механизм его действия и рекомендовать для клинического изучения в качестве гиполипидемического и/или антиатеросклеротического средства. В то же время в ходе КИ может возникнуть необходимость дополнительных исследований, направленных на выяснение других сторон действия препарата, важных для оптимизации его применения.
Относительно требований, характеризующих общую фармакологическую активность и токсичность новых гиполипидемических и антиатеросклеротических веществ, то изучение их влияния на функциональное состояние ряда органов и систем, определение острой и хронической токсичности проводится по программе, предусмотренной официальными документами Минздравсоцразвития России для всех новых веществ, представляемых для получения разрешения на клиническое изучение.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Андрианова И.П., Рыженков В.Е., Лапук Я.И. и др. Специфическое связывание холестерина энтеросорбентами // Вопр. мед. химии, 1986, 2: 80–89.
2.Богданов В.Л., Викторова Е.Н., Веселова Т.В. и др. Флуоресцентный метод регистрации продуктов пероксидации в плазме крови и липопротеидах низкой плотности // Оптический журнал, 1995, 11: 89–90.
3.Куфлина С.А., Павлова Т.Н. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации МЗ СССР. М., 1985.
4.Лопухин Ю.М., Андрианова И.П., Рыженков В.Е. и др. Энтеросорбент с иммобилизованным хлоридом триметиламиноэтанола. I. Гиполипимдемические свойства // Вопр. мед. химии, 1994, 4(1): 18–20.
5.Макаров В.Г., Рыженков В.Е., Северцева О.В. и др. Гиполипидемическое и антиоксидантное действие концентрата облепихового масла в эксперименте // Вопр. биол., мед. и фармац. химии, М., 1998, 3: 42–44.
6.Рыженков В.Е., Соловьева М.А., Ремезова О.В., Окуневич И.В. Гиполипидемическое действие сульфатированных полисахаридов // Вопр. мед. химии, 1996, 42(2): 115–119.
7.Фрешни Р. (ред.) Культура животных клеток. Методы, М.: Мир, 1989: 332.
8.Esterbauer H., Striegl H., Puhl, M. Rothededer Continuons monitoring of in vitro oxidation of human low density lipoproteins. Free Rad. Res. Commun., 1989, 6(1): 67–75.
9.Gorren A.C., Sorlie M., Andersen № et al. Tetrahydrobiopterin as combined electron protein donor in nitric oxide biosynthesis. Methods Enzymol., 2005, 396: 456-460.
10.Hodgin J.B., Maeda № Minireview: Estrogen and Mouse Models of Atherosclerosis. Endocrinology, 2002, 143(12): 4495–4501.
11.Kuron G.W., Grier №., Hu J.W. The bile acid binding and hypocholesterolemic action of two water — soluble polymers. Atherosclerosis, 1980, 37(3): 253–360.
12.Lingren F.T., Jensen L.C., Flatch F.T. Blood lipid and lipoprotems guantitation, composition and metabolism. N-Y-London-Sydney, 1972: 181–274.
13.Ross R. Atherosclerosis an inflammatory disease. New Engl. J. Med., 1999, 340(2): 115–126.
ГЛАВА 27
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ГЕМОСТАЗ
Составители: проф. В.А. Макаров; академик РАМН, проф. А.А. Спасов; д. б. н., проф. М.Б. Плотников; д. м. н. Г.Г. Белозерская; к. б. н. Т.М. Васильева; к. б. н. Н.Н Дрозд;
д.м. н., проф. А.А. Свистунов; к. м. н. А.Ф. Кучерявенко; к. б. н. Л.С. Малыхина;
к.м. н. Л.В. Науменко; к. б. н. О.Е. Неведрова; д. м. н. Н. Петрухина; д. м. н. О.И. Алиев;
д.б. н., проф. Т.М. Плотникова
Введение
Оценку специфической фармакологической активности лекарственных регуляторов функции гемостаза проводят, как правило, в несколько этапов. Первым этапом является изучение действия вещества in vitro в плазме. Однако в силу различных причин (биотрансформация препарата в активную форму в организме, непрямой характер действия и др.) отрицательный результат на первом этапе не является причиной «отстранения» вещества от исследования на следующих этапах. Не всегда также положительный результат на первом этапе (в силу быстрой биотрансформации в организме, наличия выраженных побочных эффектов и др.) является залогом возможности успешного использования его эффекта при введении в организм. Второй этап — исследование действия в условиях введения интактному животному. Этот этап позволяет определить время начала, максимума и окончания действия, степень выраженности эффекта под влиянием разных доз, выявить предпочтительные пути введения потенциального ЛС, апробировать способы снятия эффекта исследуемого вещества под влиянием специфических антагонистов или неспецифических мероприятий. В этом случае целесообразно также оценить эффект вещества или лекарственной формы на свертывающую систему крови и фибринолиз, помимо параметров, предназначенных для оценки специфической фармакологической активности. Третий этап — оценка эффекта изучаемой субстанции или лекарственной формы на фоне экспериментальной модели тромбоза или геморрагии (в зависимости от характера активности изучаемого средства).
Для характеристики особенностей действия исследуемых веществ и их активности вызываемые ими эффекты должны быть сравнены с эталонными препаратами. Желательно, чтобы препарат сравнения был близок по химической структуре и механизму действия к изучаемому средству.
Средства, влияющие на функцию гемостаза, делятся на две большие группы — противотромботические и гемостатические средства. Противотромботические средства можно разделить на ингибиторы агрегации тромбоцитов (антиагреганты), антикоагулянты, тромболитические (фибринолитические) средства и средства, влияющие на реологические свойства крови. В соответствии с этой рубрикацией далее описаны методики оценки специфической фармакологической активности исследуемых средств.
1. Исследование специфической фармакологической активности антиагрегантов
Одним из важных факторов в системе гемостаза являются тромбоциты, которым принадлежит ключевая роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Данный факт стимулировал разработку большого количества ЛП. Однако, несмотря на существование широкого спектра антиагрегантных средств, для профилактики и лечения тромботиче-
ских состояний, необходимо создание новых более совершенных препаратов, которые будут угнетать функциональную активность тромбоцитов более эффективно и безопасно, чем это выполняют известные ингибиторы агрегации.
Всвязи с этим проблема поиска фармакологических ингибиторов агрегации тромбоцитов в настоящее время является весьма актуальной задачей, тем более что расшифровка ключевой роли кровяных пластинок в тромбообразовании позволяет различать антиагрегантные препараты по основным механизмам действия в различных точках приложения, что способствует прекращению образования тромба на стадии формирования тромбоцитарных агрегатов.
Основной целью исследования специфической фармакологической активности потенциальных антиагрегантов является изучение их действия на склеивание тромбоцитов. Помимо этого в некоторых случаях представляется необходимым определить влияние веществ на изменение количества тромбоцитов и ряд параметров плазменного гемостаза: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое и тромбиновое время, концентрацию фибриногена и т.п. Последнее позволяет оценить риск развития побочных эффектов (таких как кровотечения) при применении исследуемых соединений.
Оценку специфической фармакологической активности потенциальных антиагрегантов необходимо проводить в три этапа:
1) оценка антиагрегационных свойств in vitro;
2) оценка специфической фармакологической активности in vivo на интактных животных;
3) оценка специфической фармакологической активности in vivo с использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением агрегации и адгезии тромбоцитов.
Основными путями экспериментального изучения соединений и препаратами, воздействующими на них, являются:
воздействие на баланс тромбоксана и простациклина в организме (ацетилсалициловая кислота, дазоксибен, эпопростенол);
блокирование рецепторов для эндогенных агонистов кровяных пластинок (тиклопидин, клопидогрель);
воздействие на трансмембранный транспорт кальция и перераспределение данных ионов внутри клетки (антагонисты кальция и др.);
повышение уровня цАМФ в тромбоцитах (дипиридамол, теофиллин); воздействие на мембрану тромбоцитов (ингибиторы гликопротеиновых рецепторов:
абциксимаб, эптифибатид, тирофибан).
Впоследние годы за счет внедрения протеомных и геномных технологий выявлены новые мишени действия антиагрегантных препаратов и прогнозируются новые белковые молекулы, которые участвуют в процессе активации и инактивации тромбоцитов. Однако, несмотря на столь высокотехнологичные методы, потенциальные антиагрегантные средства обязательно должны быть исследованы на животных, с использованием общепринятых и воспроизводимых методов и моделей, для дальнейшего изучения их механизмов действия.
Необходимо отметить, что проведение исследований «in vitro» не всегда возможно, так как, например, вещества могут иметь плохую растворимость, оказывать влияние на рH, иметь высокую оптическую плотность и т.д.
Кроме того, такие антиагрегантные средства, как клопидогрель и тиклопидин оказывают свой эффект за счет метаболитов и соответственно действуют только «in vivo». Таким же эффектом обладают некоторые ингибиторы гликопротеиновых рецепторов IIb/ IIIa. Однако большинство известных антиагрегантных средств оказывают ингибирующее воздействие на тромбоциты в условиях «in vitro».
1.1. Оценка антиагрегационных свойств in vitro
Изучение специфической фармакологической активности потенциальных антиагрегантов предпочтительно проводить с использованием крови здоровых доноров, которые
не принимали ЛП хотя бы в течение месяца, так как очень многие средства могут изменять функциональную активность тромбоцитов (оральные контрацептивы, анальгетики, антибиотики и др.). Также для исследования используют кровь лабораторных животных: кроликов, крыс, собак. Взятие крови должно быть приурочено ко времени исследования, чтобы свести до минимума время хранения проб.
Забор крови должен производиться в специальные пластиковые или силиконированные пробирки, так как в случае использования стеклянных пробирок происходит налипание тромбоцитов на стекло и возникает контактная активация свертывания. Кровь у здоровых доноров забирается утром натощак методом пункции локтевой вены силиконированной иглой с широким просветом (внутренний диаметр 1,0–0,8–0,6 мм) без шприца (самотеком) и без наложения жгута. Первые капли крови не используются, так как в них содержится тканевой тромбопластин. После забора кровь смешивается с антикоагулянтом в соотношении 9:1. В качестве антикоагулянтов могут использоваться цитрат натрия, оксалат натрия или калия, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Однако трехзамещенный цитрат натрия обладает специфической способностью стабилизировать лабильные факторы свертывания (V и VIII). И именно цитратная плазма, обогащенная тромбоцитами, используется для изучения их агрегации. Использование консервированной крови недопустимо. Взятие крови следует проводить непосредственно перед исследованием, используя стабилизаторы-антикоагулянты: цитрат натрия, двухнатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), гепарин, гирудин и др. Наиболее часто в качестве стабилизатора применяют цитрат натрия (3,8%-ный водный раствор), т.к. он имеет ряд преимуществ перед другими способами стабилизации крови. Для перемешивания крови с цитратом необходимо немедленное 3–4-кратное аккуратное переворачивание закрытой пробирки после ее заполнения до требуемого объема. При этом не допускается образование пены. Нельзя трясти пробу, так как это может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов. Раствор цитрата натрия легко подвергается бактериальному загрязнению, ослабляющему его антикоагулянтное действие, в связи с чем его необходимо обновлять не реже одного раза в неделю и хранить в холодильнике во флаконе с плотно притертой пробкой. При заборе кровь смешивается с цитратом натрия в соотношении 9:1.
При исследовании агрегации тромбоцитов наиболее часто используется богатая тромбоцитами плазма. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь сразу после получения (во всяком случае, не позднее чем через 30 мин) центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносят в другую пробирку, а остаток центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Бедную тромбоцитами плазму используют в качестве оптического контроля при исследовании тромбоцитарной агрегации по методу G.Born [1].
Полученную богатую тромбоцитами плазму или суспензию тромбоцитов необходимо стандартизировать по количеству тромбоцитов, которое должно быть примерно одинаковым во всех пробах и составлять около 250–300 тыс/мкл. В качестве разводящей жидкости используют или бедную тромбоцитами плазму (при работе с богатой тромбоцитами плазмой), или буферный раствор для суспензирования клеток. Подсчет тромбоцитов может осуществляться разными способами: подсчет в камере Горяева, с использованием обычного или фазово-контрастного микроскопа или на гематологическом анализаторе.
При исследовании воздействия антиагрегантов на тромбин-индуцированную агрегацию тромбоцитов необходимо освободить эти клеточные элементы от присутствия плазмы, что можно осуществить двумя способами: отмывкой тромбоцитов в буфере, содержащем 0,14 M NaCl, 11,9 mM NaHCO3, 5,4 mM KCl, 1,0 mM MgCl2, 0,1% глюкозы и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (рН=7,35), путем повторного центрифугирования с последующим ресуспензированием или гель-фильтрацией. При изучении антиагрегационного эффекта веществ, влияющих на активность эндогенного тромбина (таких как гирудин, гирулог, гепарин и т.п.), можно воспользоваться методом Е.F. Plow
и соавторов [2] где возможность оценки агрегации тромбоцитов в плазме под действием эндогенно генерируемого тромбина достигается использованием ингибитора полимеризации фибриногена, представляющего собой тетрапептид Gly-Pro-Arg-Pro.
Необходимо помнить, что любые манипуляции с тромбоцитами можно проводить только в посуде, сделанной из тромборезистентного материала (пластик, специально подготовленное стекло). Исследование агрегационной активности тромбоцитов должно проводиться в течение трех часов после забора крови. В течение всего периода исследования кровь и богатая тромбоцитами плазма должны находиться при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов и предагрегационную инкубацию с изучаемыми веществами следует осуществлять при 37°С.
Вне зависимости от используемого проагреганта полученную богатую тромбоцитами плазму или суспензию тромбоцитов необходимо стандартизировать по количеству клеточных элементов, которое должно быть примерно одинаковым во всех сравниваемых исследованиях и составлять около 250 тыс/мкл. В качестве разводящей жидкости следует использовать аутологичную бестромбоцитарную плазму (при работе с богатой тромбоцитами плазмой), или буферный раствор, в котором было проведено ресуспензирование клеток. В случае низкого содержания тромбоцитов (менее 100 тыс/мкл) результат исследования не является достоверным.
Перед началом проведения эксперимента необходимо оценить растворимость изучаемого вещества. Наиболее предпочтительными растворителями являются физиологический раствор, буферы с нейтральным значением рН, дистиллированная вода. При использовании в качестве растворителя спирта или ДМСО следует помнить о том, что количество вводимого раствора не должно превышать 1–2% от общего объема реакционной смеси. Во всех случаях вне зависимости от природы растворителя следует проводить контрольное изучение его возможного влияния на агрегацию тромбоцитов.
Для исключения возможного изменения чувствительности тромбоцитов к проагреганту, растворителю или исследуемому веществу под влиянием времени, прошедшего с момента приготовления плазмы, контрольные записи агрегатограммы необходимо осуществлять до начала эксперимента, через равные промежутки времени в ходе исследования (например, каждая 3-я агрегатограмма должна быть контрольной), а также по завершении исследования.
Тромбоцитарную агрегацию исследуют с помощью специальных приборов — агрегометров. В настоящее время существует множество фирм-производителей, наиболее известными из которых являются Chrono-Log Corporation (США), Biola (Россия), Helena Laboratories Corporation (Великобритания) и др.
Для исследования агрегации тромбоцитов используют следующие методы: 1. Оптический метод, предложенный G.Born [1].
Данный метод является самым распространенным как в клинической, так и в научноисследовательской практике. О степени агрегации чаще всего судят по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции по сравнению с исходной величиной. В качестве оптического контроля используют плазму, не содержащую тромбоцитов. Исследуемое вещество добавляют в кювету Объемы вводимой в кювету агрегометра плазмы и проагреганта зависят от технических характеристик прибора.
Объем исследуемого антиагреганта не должен быть большим, так как излишнее разведение плазмы или суспензии тромбоцитов может привести к заметному изменению оптических свойств реакционной смеси и повлиять на результаты эксперимента. Обычно раствор изучаемого вещества при использовании растворителей, не влияющих на физиологическую активность тромбоцитов (физиологический раствор, буферы для работы с клетками крови, аутологичная бестромбоцитарная плазма), не превышает 10% от общего объема реакционной смеси.
2. Импедансный метод, разработанный The Wellcome Research Laboratories, Beckenham, England [3] и позволяющий исследовать тромбоцитарную агрегацию в цельной крови.
В данном методе регистрируется изменение сопротивления между электродами, погруженными в исследуемый образец крови, которое происходит при агрегации тромбоцитов.
Следует отметить, что некоторые модели агрегометров снабжены специальными люминесцентными каналами, позволяют также исследовать выброс АТФ и ионов Са2+ из тромбоцитарных гранул.
Выбор проагреганта зависит от предполагаемого механизма действия изучаемого вещества. Во всех случаях целесообразно использовать такие проагреганты, как аденозиндифосфорную кислоту (АДФ), коллаген и адреналин, стимулирующие различные пути активации тромбоцитов. В схему оценки антиагрегационного эффекта веществ — антагонистов тромбоксановых рецепторов следует включить исследование их влияния на агрегацию тромбоцитов, индуцированную арахидоновой кислотой, а в схему исследования потенциальных блокаторов PAR-рецепторов — тромбин.
Чаще всего АДФ используют в конечных концентрациях 2–1×10-5 М (для записи одноволновой агрегатограммы) и 0,5×10-5 М (для индукции двухволновой агрегации тромбоцитов, часто используемой при исследовании реакции высвобождения тромбоцитарных гранул), коллаген — 50,0 мкг/мл. Адреналин используют в конечных концентрациях 2,5–1,0 мкг/мл (для индукции одноволновой агрегации) и 0,5 мкг/мл (для индукции двухволновой агрегации), тромбин — 0,3 ЕД/мл и арахидоновую кислоту — 10-3–10-4 М.
Оценку антиагрегационного эффекта потенциальных ингибиторов функциональной активности тромбоцитов наиболее корректно проводить с использованием величины IC50, то есть следует рассчитать, какое количество антиагреганта (в молярном выражении) необходимо для снижения величины максимальной амплитуды агрегации на 50%. Следует отметить, что снижение агрегационной способности на 50% и более является терапевтическим уровнем действия антиагреганта.
Обязательным условием достоверной оценки эффективности исследуемой субстанции и возможности сравнения антиагрегационных свойств нескольких потенциальных ЛС является использование индуктора процесса межтромбоцитарного взаимодействия
водной и той же концентрации во всех исследованиях. Также необходимо проводить ряд повторных экспериментов на плазме нескольких (обычно 5–10 доноров), с целью исключения влияния индивидуальной чувствительности к исследуемому веществу.
Следует отметить, что проведение исследований in vitro не всегда возможно. Так, популярные в клинике антиагреганты тиклопидин и клопидогрель (ингибиторы АДФиндуцированной агрегации) неактивны in vitro, но за счет эффекта своих метаболитов оказывают выраженное действие in vivo. Подобным же эффектом обладают и некоторые антагонисты фибриногеновых рецепторов тромбоцитов GPIIb/IIIа (например, фрадафибран). Проведение этого исследования не всегда возможно также в силу плохой растворимости вещества, его высокой оптической плотности, резкого влияния на рН и др.
Для изучения антиагрегантной активности исследуемые вещества используются
вразличных концентрациях. Все они должны хорошо растворяться в воде или при нагревании. В случае если изучаемые соединения нерастворимы в воде, можно воспользоваться другими растворителями. Однако при использовании в качестве растворителя спирта следует помнить о том, что количество вводимого спиртового раствора не должно превышать 1–2% от общего объема реакционной смеси. Другой растворитель, например, ДМСО, должен также использоваться в объемах, не вызывающих повышения функции кровяных пластинок. Таким образом, во всех случаях независимо от природы растворителя следует проводить контрольное изучение его возможного влияния на агрегацию тромбоцитов.
1.2. Оценка антиагрегационных свойств in vivo
Вторым этапом исследований является оценка специфической фармакологической активности in vivo на интактных животных. На данном этапе изучения антиагрегантной активности соединений очень важно правильно выбрать экспериментальных животных.
Необходимо прежде всего учитывать видоспецифичность действия изучаемых веществ, а также особенности системы свертывания крови и метаболизма у животных.
Чаще всего антиагрегантную активность «in vivo» изучают на кроликах, крысах, собаках, мышах.
Все животные должны содержаться в условиях вивария (температура 22–24 °С, относительная влажность воздуха 40–50%) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92), соблюдая правила лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правила и Международные рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Важным моментом, в существенной степени определяющим успех проведения данного этапа доклинического изучения потенциальных антиагрегантов, является правильный выбор вида экспериментальных животных. При этом прежде всего следует руководствоваться видоспецифичностью действия изучаемых препаратов, а также особенностями системы свертывания крови и метаболизма, имеющими место у животных — объектов эксперимента. Например, исследование отдельных групп препаратов (например, некоторых блокаторов GPIIb/IIIа-рецепторов) на кроликах невозможно вследствие видовых особенностей.
Кроме того, следует учитывать, что у мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки) сложнее проводить многократное взятие крови и практически невозможно делать это в необходимом для исследования объеме. Если исследуемое вещество не обладает какими-либо особенностями, делающими невозможным изучение его фармакодинамики с использованием именно этого вида животного, наиболее доступными и удобными для проведения изучения антиагрегантов являются кролики.
Введение исследуемых веществ кроликам возможно различными способами; наиболее часто используют пероральный и внутривенный пути введения. В качестве растворителя необходимо использовать стерильный физиологический раствор или дистиллированную воду (при пероральном введении). При внутривенном введении вещества вводят
вкраевую вену уха, при пероральном введении — с помощью зонда непосредственно в желудок экспериментального животного.
Взятие крови у кроликов осуществляется из краевой вены уха методом свободного падения капель, приемы стабилизации крови, приготовления и хранения богатой тромбоцитами и бестромбоцитарной плазмы не отличаются от таковых при работе с кровью человека. Следует, однако, учитывать, что количество тромбоцитов у кроликов существенно выше, поэтому стандартизация плазмы по числу клеток часто требует более существенного ее разведения.
Общий объем крови, взятой у кролика в течение одного дня эксперимента, не должен превышать 20–25 мл. Если условия исследования предполагают использование крови
внесколько больших количествах, то необходимо провести контрольное исследование влияния кровопотери, выполненной в режиме основного эксперимента, на функциональное состояние системы гемостаза у животных. Проведение контрольного эксперимента также предполагает и внутривенное введение исследуемого вещества в большом объеме растворителя (10 мл и более), т.к. оно может вызвать увеличение объема циркулирующей крови и таким образом повлиять на число и агрегационную активность тромбоцитов. В данном случае в контрольном эксперименте в краевую вену уха кролика вводят эквивалентное количество физиологического раствора.
Также необходимо определение агрегации тромбоцитов до момента введения исследуемого вещества. После введения кровь забирают через определенные промежутки времени, длительность которых определяется природой и свойствами изучаемого соединения. Так, при исследовании простагландинов (вследствие их быстрой инактивации в организме) забор крови необходимо осуществлять практически сразу же после введения,
вто время как при использовании блокаторов АДФ-рецепторов необходимо некоторое
время для их превращения в активные метаболиты и появления антиагрегационного эффекта.
Для исследования влияния потенциального антиагреганта на функциональную активность тромбоцитов in vivo также наилучшим является метод регистрации агрегации тромбоцитов, предложенный G.Born. Так как чувствительность к проагрегантам тромбоцитов кроликов отличается от чувствительности человеческих тромбоцитов, наиболее информативными индукторами агрегации являются АДФ в конечной концентрации 10-5 М и коллаген.
Выбор методики определения числа тромбоцитов может быть достаточно свободным, но, учитывая, что количество тромбоцитов у кролика в 2–3 раза превышает этот показатель у человека и, следовательно, затрудняет и так непростую процедуру подсчета этих клеток в мазке или камере Горяева, мы рекомендуем воспользоваться фотометрическим методом В.Walkowiak и соавторов [4].
1.3.Оценка специфической фармакологической активности in vivo
сиспользованием экспериментальных моделей повышенной агрегации
и адгезии тромбоцитов
Основной задачей данного этапа доклинического изучения новых антиагрегантов in vivo с использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением агрегации и адгезивности тромбоцитов, является оценка их противотромботической активности.
Моделью клеточного тромба, обусловленного преимущественно тромбоцитами, может служить следующая методика. Модель адгезивного тромбоза создается на микрососудах брыжейки крыс. К венулам диаметром 40–90 микрон подводится электрод с диаметром 5–8 микрон. Анодным током, напряжением 100 В и силой 4 мА вызывают образование тромбоцитарного тромба. Время нанесения раздражения 20 мсек. С помощью объект-микрометра определяют время возникновения тромба, время отрыва первого конгломерата от основной массы тромба и среднюю площадь тромба.
Для исследований эффективности антиагрегантов можно использовать экспериментальный тромбоз сосудов артериального русла (коронаротромбоз, тромбоз бедренной артерии и т.п.). В качестве критериев оценки влияния антиагрегантов на тромбогенез следует выбрать такие тесты, которые позволили бы прямо и желательно количественно оценить именно тромбообразование. Такими критериями могут быть размер или вес модельного тромба. Кроме того, в качестве модельного состояния можно использовать экспериментальное диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. В этой ситуации критериями оценки противосвертывающего эффекта антиагрегантов могут быть число тромбоцитов, уровень продуктов паракоагуляции, степень потребления фибриногена или антитромбина III и другие показатели, отражающие тяжесть ДВС-синдрома.
Моделью клеточного тромбоза для тестирования потенциальных антитромботических агентов, первично действующих на агрегацию тромбоцитов, является модель DiMinno G [5]. Данная модель создается на мышах. В качестве тромботического агента используется смесь растворов коллагена (0,5 мг/кг) и адреналина (0,06 мг/кг), которая вводится в хвостовую вену животного. Исследуемые соединения и препараты сравнения вводятся животным в соответствии с предполагаемыми и использующимися путями введения в клинической практике. В качестве критерия образования тромбов фиксируется количество погибших животных и наличие тромбов в сосудах легких. Из данных литературы [5] известно, что в обсуждаемой методике непосредственная причина гибели животных — массивная окклюзия микрососудов легких тромбоцитарными агрегатами, поэтому при тестировании на данной модели потенциальных антиагрегантных средств желательно провести гистологический контроль сосудов легких животных.
Также часто используется модель артериального тромбоза, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) (Kurz K.D., 1990) [6]. Моделирование можно проводить на сонной, брюшной аорте, сосудах брыжейки крыс. Принцип
метода состоит в том, что наложение ватного диска, смоченного хлоридом железа, на выбранный сосуд вызывает в данном месте образование тромбоцитарного тромба. Время нанесения ватного диска составляет от 3 до 10 мин, либо возможно постоянное воздействие. Оценка времени образования тромба может проводиться с использованием различных приборов, в том числе помощи доплерографических ультразвуковых исследований. Также можно прямо и количественно оценить тромбообразование путем оценки размера и массы модельного тромба и при помощи морфологических исследований.
Другая модель артериального тромбоза проводится согласно [7]. Отличие от предыдущей модели состоит в том, что в данном случае тромбоз индуцируется анодным током напряжением 100 В и силой 50 мА. Время нанесения раздражения может варьировать от 3 до 15 мин.
Исследования антитромбогенной активности веществ должно проводиться с опреде-
лением ЭК50.
Другой экспериментальной моделью для изучения антиагрегантной активности потенциальных ингибиторов агрегации тромбоцитов может являться модель экспериментального сахарного диабета. Хорошо известно, что в лечении сахарного диабета большое значение придается не только стабилизации углеводного обмена, но и профилактике ангиопатий.
Согласно клиническим рекомендациям зарубежных и российских стандартов лечения сахарного диабета, схемы назначения ЛС помимо сахароснижающей терапии включают использование для профилактики диабетических ангиопатий антиагрегантных препаратов. Поэтому использование данной модели для изучения потенциальных антиагрегантных средств может быть весьма актуальным. Исследования можно проводить на крысах или собаках с тяжелым (уровень глюкозы более 18 ммоль/л) экспериментальным стрептозотоцинили аллоксан-индуцированным сахарным диабетом. Для комплексной оценки агрегатного состояния крови определяются различные параметры активации тромбоцитов, описанные выше. Материалом для исследования является плазма крови крыс с сахарным диабетом. Кроме того, на животных с экспериментальным сахарным диабетом возможно создание некоторых моделей тромбозов. В данном случае время возникновения тромбоза у животных с диабетом сравнивается с таковым у интактных крыс.
1.4.Препараты сравнения
Внастоящее время известно более двадцати ЛП, которые способны снижать агрегационную способность тромбоцитов, влияя на различные пути активации этих клеток. Основными группами антиагрегантов являются следующие:
1. Ингибиторы циклооксигеназы-1 тромбоцитов. К ним относится ацетилсалициловая кислота (аспирин), индобуфен.
2. Антагонисты тромбоцитарных рецепторов АДФ P2Y12. В эту группу объединяют тиенопиридины — тиклопидин (тиклид), клопидогрель (плавикс) и празугрель, необра-
тимо ингибирующие активность P2Y12 , а также обратимые антагонисты этого рецептора — AZD6140 (для перорального применения) и ARC69931MX (кангрелор) для внутривенного использования. Два последних вещества проходят третью фазу КИ.
3. Антагонисты рецепторов фибриногена — гликопротеинов IIb/IIIa (GP IIb/IIIa).
Вклинической практике широко применяются препараты для внутривенного введения — абциксимаб (РеоПро), эпифибатид (интегрилин), тирофибан (агграстат). В России в 2007 году также начали выпуск первого отечественного антагониста GP IIb/IIIa — препарата монофрам, предназначенного для внутривенного введения и по своим свойствам сходного с препаратом абциксимаб. Высокая эффективность данной группы антиагрегантов подтверждена во многих КИ. Также разрабатываются GP IIb/IIIa-блокаторы для орального применения — ксемилофибан, орбофибан, сибрафибан, лотрафибан и другие.
4. Ингибиторы фосфодиэстеразы, повышающие уровень цАМФ в тромбоцитах: дипиридамол и трифлюзал (последний также ингибирует тромбоцитарную циклоокигеназу-1).
