Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать про- и противовоспалительную активность препарата в культуре ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на возможность регулирования этим препаратом воспалительного процесса в организме.
7. Исследование способности лекарственных средств, влияющих на эндотелий кровеносных сосудов, активировать продукцию вазодилятатора и вазоконстриктора
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата индуцировать в культуре ЭКПВЧ продукцию вазодилятатора и вазоконстриктора. Задача эксперимента заключается в определении дозы препарата, активирующую или ингибирующую продукцию ЭКПВЧ вазодилятатора оксида азота и вазоконстриктора эндотелина-1. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ИФН гамма (1×104 МЕ/мл) в среде роста (контроль продукции оксида азота и эндотелина-1) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5 % СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20°С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание нитритов — стойких метаболитов оксида азота и эндотелина-1. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Содержание всех показателей в исследовании выражают в процентах относительно уровня этих же показателей в контроле. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в процентах вместе с результатами, полученными при использовании контроля индукции оксида азота и вазоконстриктора эндотелина-1 (ИФН гамма).
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать способность препарата индуцировать в культуре ЭКПВЧ продукцию вазодилятатора и вазоконстриктора и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на возможность влияния препарата как на тонус сосудов, так и на противо- и провоспалительные события соответственно в организме.
8. Исследование способности препарата влиять на продукцию фактора коагулянтной активности — фактора вон Виллебранда
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата активировать или ингибировать продукцию фактор вон Виллебранда культурой ЭКПВЧ. Задача эксперимента заключается в определении дозы препарата, активирующей или ингибирующей продукцию фактор вон Виллебранда культурой ЭКПВЧ. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24 луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ИФН гамма (1×104 МЕ/мл) в среде роста (контроль ингибиции продукции фактор вон Виллебранда) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5 % СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20°С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание фактор вон Виллебранда. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Содержание всех показателей в исследовании выражают в процентах относительно уровня этих же показателей
в контроле. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в процентах вместе с результатами, полученными при использовании контроля ингибиции продукции фактор вон Виллебранда (ИФН гамма).
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать способность препарата влиять на продукцию фактор вон Виллебранда культурой ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на возможность влияния препарата на тромбообразование и воспалительный процесс.
9. Исследование способности препарата влиять на продукцию фактора ангиогенеза матриксной металлопротеиназы-1
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата активировать или ингибировать продукцию матриксной металлопротеиназы-1 культурой ЭКПВЧ. Задача эксперимента заключается в определении дозы препарата, активирующей или ингибирующей продукцию ЭКПВЧ матриксной металлопротеиназы-1 культурой. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ИФН гамма (1×104 МЕ/мл) в среде роста (контроль ингибиции продукции матриксной металлопротеиназы-1) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5% СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20°С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание матриксной металлопротеиназы-1. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Содержание всех показателей в исследовании выражают в процентах относительно уровня этих же показателей в контроле. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в процентах вместе с результатами, полученными при использовании контроля ингибиции продукции матриксной металлопротеиназы-1 (ИФН гамма).
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать способность препарата влиять на продукцию матриксной металлопротеиназы-1 культурой ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на возможность влияния препарата на ангиогенез, воспалительный процесс, репарацию тканей организма, антиканцерогенез.
10. Интерпретация результатов
Выполнение методических рекомендаций в полном объеме дает комплексную характеристику исследуемого препарата.
Способность исследуемого препарата индуцировать продукцию интерферона в культуре эндотелия характеризует его антивирусные свойства, которые в организме могут реализоваться как местно — в эндотелии сосудов, предотвращая его инфицирование, так и на системном уровне. Подавление репродукции вируса простого герпеса 1 типа под воздействием препарата указывает на специфический антивирусный потенциал препарата. Активация продукции цитокинов характеризует иммуномодулирующий потенциал препарата, т. е влияние на процессы сначала клеточного, а затем и гуморального иммунитета. Активация продукции провоспалительных цитокинов под воздействием препарата является показателем того, что под их влиянием произойдет активация экспрессии МКА на эндотелии и начнется процесс миграции лейкоцитов — первого этапа воспаления, цель которого заключается в элиминации патогена. Увеличение уровня растворимых МКА указывает на регуляцию препаратом рекрутирования лейкоцитов и их миграции в очаг воспаления; значительная степень увеличения уровня растворимых МКА указывает на
возможность значительного уменьшения под воздействием препарата миграции лейкоцитов, т.е. этот факт отражает противовоспалительное действие препарата. Увеличение продукции вазодилятаторов является показателем способности препарата снижать артериальное давление, тогда как увеличение продукции вазоконстрикторов приводит к увеличению артериального давления. Кроме этого, активация продукции вазодилятатора оксида азота указывает на противовоспалительное действие препарата по принципу обратной связи, тогда как активация продукции вазоконстриктора приводит к активации воспаления. Увеличение уровня фактора вон Виллебранда является протромботической характеристикой препарата, тогда как уменьшение уровня фактора вон Виллебранда указывает на антитромботическое действие препарата. Увеличение уровня матриксной металлопротеиназы 1 типа характеризует препарат как ангиогенный, тогда как ее уменьшение указывает на антиангиогенные свойства препарата.
Заключение
Метод оценки действия фармпрепаратов и химических соединений на функциональное состояние эндотелия кровеносных сосудов, представленный в данных Методических рекомендациях, является достаточно простым и надежным. Этот метод оценки дает возможность наиболее полно и разносторонне охарактеризовать как вновь синтезируемые вещества при их скрининге, так и уже используемые фармпрепараты по результатам воздействия на основные показатели функциональной активности эндотелия сосудов: интерферониндуцирующую, антивирусную и иммуномодулирующую активности, анти- и провоспалительный процесс, тромбообразование, тонус сосудов, ангиогенез. Результатом такой оценки является выявление специфических свойств веществ, влияющих на функциональную активность эндотелия при скрининге и расширение показаний для использования уже известных фармпрепаратов и их комбинаций в клинической практике.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Велично Г.Н., Шуляк А.Ф., Склянкина Н.Н., Щегловитова О.Н. Культура клеток эндотелия кровеносных сосудов — модельная система для оценки лекарственных препаратов // Цитология, 2009. — 151, 757.
2.Ершов Ф.И., Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина, 1996.
3.Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. — СПб.: Фолиант, 2008. — 3.
4.Щегловитова О.Н., Куроптева З.В., Наглер Л.Г., Склянкина Н.Н., Болдырева Н.А., Байдер Л.М., Молдашев Ж.Т. Влияние интерферона α на продукцию оксида азота клетками эндотелия сосудов человека, инфицированными вирусом простого герпеса 1 типа // Иммунология, 2009. — 30, 5, 279–282.
5.Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерфероны в теории и практике медицины. — М.: Медицина, 1981.
6.Щегловитова О.Н. Межклеточные взаимодействия в сосудистой стенке — первые шаги в регуляции гомеостаза и в патогенезе заболеваний. Интерферону — 50 лет. — М., 2007.
7.Beilke M.A. Vascular endothelium in immunology and infectious diseases. Rev. Infect. Dis. 1989, 41, 273–283.
8.Biederman B.C. Vascular endothelium: checkpoint for inflammation and immunity. New Physiol Sci 2001; 16: 84–88;
9.Cines D.B., Pollak E.S., Buck C.A., et al. Endothelial cells in the physiology of Vascular Disorders. J of Amer Sоc Hemathol 1998; 91: 3527–3561.
10.Garton K.J., Gough P.J., Raines E.W. Emerging role for ectodomain shedding in the regulation of inflammatory responces. J Leukemic Biol 2006; 79: 1105–1116.
11.Ja e E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical vein-idebtification by morphologic and immunologic criteria. J. Clin Invest 1979; 52: 2745–2756.
12.Pober J.S., Cotran R.S. Cytokines and Endothelial cell Biology. Physiol. Rev. 1990, 70, 2, 427–451.
13.Tedgui A, Mallat Z. Anti-inflammatory Mechanisms in the Vascular Wall. Circ Res 2001; 88: 877– 887.
14.Smith C.W., Adhesion molecules and receptors. J. Allergy Clin Immunol 2008; 121: 8375–8379.
15.Vestweber D. Endothelial cell contacts in inflammation and angiogenesis. International Congress Series 2007; 1302: 17–25.
16.Witkowska A.M., Borawska M.H.. Soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1): an overview. Eur Cytok Netw 2004; 15: 91–98.
17.Wong D., Prameya R., Dorovini-Zis K. Adhesion and migration of polymorphonuclear leukocytes across human brain microvessel endothelial cells are di erently regulated by endothelial cell adhesion molecules and modulate monolayer permeability. J Neuroimmunology 2007; 184: 136–148.
ГЛАВА 26
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО И АНТИСКЛЕРОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Составители: д. м. н., проф. В.Е. Рыженков; д. м. н., проф. В.Г. Макаров; д. м. н. О.В. Ремезова; к. б. н. М.Н. Макарова
Введение
До настоящего времени основной причиной большой инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах, в том числе в России, являются сердечнососудистые заболевания, в основе которых лежит атеросклероз.
Многочисленные экспериментальные, клинические и эпидемиологические исследования позволили выделить факторы риска (ФР) развития атеросклероза и его осложнений — ишемической болезни сердца (ИБС), поражений артерий головного мозга и нижних конечностей. Среди них — нарушение липидного и липопротеинового (ЛП) обменов (дислипопротеинемии атерогенного характера). При этом наиболее существенным является увеличение в крови атерогенных липопротеинов: а) ЛП низкой плотности (ЛПНП или бета-ЛП), отражающееся в нарастании общего холестерина (ХС) в крови и в этом классе ЛП; б) липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП или пребета-ЛП), отражающееся в увеличении триацилглицеридов (ТГ) в крови; в) особого липопротеина (ЛПа), липидный состав которого близок ЛПНП, но его апобелок представляет собой гликопротеин, напоминающий плазминоген, что способствует атеротромботическому поражению артерий. Второй важной причиной, способствующей атерогенезу, является снижение в крови антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ЛПВП или альфа-ЛП), отражающееся в уменьшении содержания ХС этого класса ЛП (альфа-ХС). Кроме того, установлено, что высокая атерогенность ЛПНП связана с возможностью их окисления, при этом атерогенез запускают именно окисленные ЛПНП (ок-ЛПНП).
Развитие дислипопротеинемии атерогенного характера обусловлено действием многочисленных неблагоприятных факторов среды, сопутствующими заболеваниями, наследственной предрасположенностью. Одна из важных причин — нарушение функционального состояния печени, которая играет ключевую роль в обмене липидов и ЛП. В печени синтезируются ХС, ТГ, насцентные (до конца не сформированные) ЛПВП, ЛПОНП, желчные кислоты, а также аполипопротеины. В печени состредоточено около 70% рецепторов, акцептирующих атерогенные ЛП (апо В, Е-рецепторы), и только в ней имеется ферментная система окисления ХС (7-альфа-холестерингидроксилаза).
На коррекцию названных нарушений направлено действие гиполипидемических средств. Особенно благоприятным считается эффект гиполипидемического препарата, если наряду со снижением повышенного уровня общего ХС и/или ХС ЛПНП наблюдается уменьшение окисления последних, увеличение сниженного содержания ХС ЛПВП (нарастание альфа-ХС), а также нормализация функции печени.
Применение гиполипидемических средств необходимо и при таких заболеваниях, как сахарный диабет и гипотиреоз, при метаболическом синдроме, а также при трансплантации органов и коронарном шунтировании, так как в этих случаях развивается дислипопротеинемия атерогенного характера, значительно утяжеляющая течение основного
заболевания и послеоперационного периода, а при сахарном диабете выступающая в качестве одной из причин большой смертности от осложнений атеросклероза.
Кроме названных ФР развития атеросклероза в последнее время большое значение придается раннему развитию дисфункции эндотелия артерий, что связанно со снижением образования защитных факторов, преимущественно оксида азота (NO) из его предшественника L-аргинина в результате снижения активности эндотелиальной синтазы NO (e-NOS). Одной из причин может быть нарушение синтеза или восстановления ключевого кофермента тетрагидробиоптерина, что наряду со снижением синтеза NO приводит к избыточной продукции супероксид-анион радикала и образованию токсичного для клеток пероксинитрита.
Подобный дисбаланс функционирования eNOS наблюдается у пожилых людей, при развитии гипертонической болезни, ИБС, сахарного диабета. Избыточная продукция супероксиданион радикала и пероксинитрита активирует ядерный транскрипционный фактор каппа В (NF-κB), который инициирует образование провоспалительных цитокинов и медиаторов. В результате происходит увеличение проницаемости артериальной стенки для компонентов крови, в том числе и для атерогенных ЛП. Активированные макрофаги взаимодействуют с ок-ЛПНП как посредством неспецифических, ненасыщаемых скевенджер- рецепторов,такиспецифическихэкспрессирующихсялектиноподобныхрецепторовLOX-1, что способствует выработке молекул адгезии и последующей седементации макрофагов на поверхности сосудов. Со временем макрофаги переполняются липидами и превращаются в пенистые клетки, формируя атеросклеротические бляшки на стенке сосудов.
Окончательное формирование атеросклеротической бляшки (в частности ее капсулы) происходит при экспрессии генов пролиферации интимы артерий, особенно гладкомышечных клеток с последующей их миграцией в места образования пенистых клеток.
Эти механизмы атерогенеза обусловливают поиск средств, препятствующих метаболическим нарушениям артериальной стенки и способных ингибировать ее воспаление, в том числе посредством влияния на названные рецепторные механизмы.
1. Экспериментальное изучение новых веществ гиполипидемического и/или антиатеросклеротического действия
Липидный и липопротеиновый спектры сыворотки крови экспериментальных животных разных видов различаются (у крыс много ХС содержится в антиатерогенных ЛПВП, у морских свинок почти полностью — в атерогенных ЛП, у кроликов ХС более равномерно распределен между фракциями ЛП). В этой связи для более объективной оценки гиполипидемического действия новых веществ исследования рекомендуется проводить на 2–3 видах животных.
Экспериментальное изучение новых веществ проводится в сравнении с референтными препаратами, применяемыми в качестве гиполипидемических средств. Выбор препарата сравнения связан с химическим строением нового соединения и с предполагаемым механизмом действия. Так, при изучении новых веществ с возможной способностью связывать желчные кислоты в кишечнике и выводить их из организма в качестве препарата сравнения широко используется желчный секвестрант холестирамин. Для новых соединений с возможным преимущественным действием на повышенное содержание ТГ и соответственно ЛПОНП наиболее широко используются фибраты, например, безафибрат, ципрофибрат или фенофибрат. Если же изучаемое соединение может ингибировать биосинтез ХС, то в качестве препарата сравнения применяют ловастатин (мевакор) или флувастатин.
В опытах in vitro на клетках млекопитающих или тест-системах данные ингибиторы применяются в виде субстанций и часто входят в состав тест-системы. Так, например, в состав тест-системы фирмы Sigma по исследованию активности HMG-CoA редуктазы входит правастатин.
Предварительно определяется острая токсичность новых веществ и для исследования избирается одна и та же часть от ЛД50 (но не более 1/10 части) как нового, так и референтного препарата.
Используются разные модели индуцирования гиперлипидемии и дислипопротеидемии у животных разных видов. Исследуется способность нового соединения оказывать как профилактическое, так и лечебное действие.
Профилактическое действие связано со способностью изучаемого соединения снижать (или полностью предупреждать) развитие гиперлипидемии и дислипопротеидемии, а также атеросклеротического повреждения артерий. В этих случаях изучаемое соединение вводится предварительно — в течение нескольких дней перед применением агента, индуцирующего развитие названных нарушений. Кроме того, считаются профилактическим действием результаты, полученные при одновременном применении изучаемого нового вещества с агентом, приводящим к развитию нарушений липидного обмена и/или атеросклероза (например, атерогенной диеты).
Лечебным действием изучаемого препарата является его способность снижать уже развившуюся гиперлипидемию или оказывать регрессию сформировавшегося атеросклеротического поражения артерий. В этом случае изучаемое новое соединение начинают вводить после развития названных патологий.
Особенностью изучения специфической гиполипидемической активности новых веществ является обязательное внутрижелудочное их введение животным, так как препараты этой группы применяются, как правило, перорально. В случае исследования активности готовой лекарственной формы нового соединения, например таблеток, учитывается содержание действующего начала, а также количество и состав вспомогательных веществ. Последние вводятся контрольной группе животных в количестве, соответствующем введению их получающей ЛС группе в составе таблеток.
Определение содержания основных липидов — общего ХС, a-ХС, ТГ в сыворотке крови, общего ХС и ТГ в печени, общего ХС в ткани аорты проводится после экстракции их органическими растворителями с помощью общепринятых, описанных в литературе методов. При возможности используются автоматизированные методы. Можно рекомендовать применение стандартизированных наборов, имеющихся в продаже, для определения общего ХС, a-ХС, ТГ. Изучение спектра ЛП сыворотки крови проводится описанными в литературе методами — электрофорезом сыворотки крови в полиакриламидном геле или на бумаге, ультрацентрафугированием ее в соответствующем градиенте плотности калия бромида. Ориентировочно можно использовать метод осаждения суммарной фракции ЛПНП + ЛПОНП из сыворотки крови гепарином в присутствии Mn2+, причем после центрифугирования в супернатанте остаются ЛПВП. Определение в этих фракциях ХС позволяет дифференцировать его содержание в атерогенных (апо В-содержащих) ЛП и в антиатерогенных ЛПВП (a-ХС). Эта процедура позволяет определить и степень пероксидации атерогенных и антиатерогенных ЛП путем изучения содержания окисленных продуктов в соответствующих фракциях. Последнее имеет значение для дополнительной характеристики спектра действия нового препарата.
1.1.Изучение гиполипидемической активности новых веществ
висследованиях на крысах
Для индуцирования гиперлипидемии у крыс применяют несколько способов:
1). С целью скрининга гиполипидемической активности новых соединений применяют поверхностно-активные вещества (например, внутрибрюшинное введение Твина-80 в дозе 200 мг/100 г веса), что приводит к быстрому (через 8–10 ч) увеличению уровня липидов в крови (особенно ТГ) и снижению a-ХС. Масса тела животных должна быть 350–400 г (14– 18 недель), так как у молодых животных гиперлипидемия трудно воспроизводится этим способом. Исследуемые вещества вводят перорально, одновременно с твином или предварительно, в течение 6–10 дней. Кровь получают у голодавших животных. В сыворотке крови определяют содержание общего ХС, a-ХС, ТГ, в печени — ХС и ТГ.
2). Одним из широко применяемых способов индуцирования гиперлипидемии у крыс является длительное (2–3 недели) применение диеты, содержащей ХС (3%), хо-
левую кислоту (0,5%) и растительное масло, предварительно прогретое при высокой температуре в течение 5 ч и охлажденное. Иногда в диету добавляют витамин D2, способствующий липидозу аорты. Сроки применения гиперлипидемической диеты могут варьировать в зависимости от изменений состава ингредиентов. Животных подвергают эвтаназии через 14–18 ч голодания. Этот срок необходим для исключения возможности влияния диеты на содержание липидов (особенно ТГ) в крови. Данная модель гиперлипидемии варьирует как по соотношению ингредиентов в диете, так и по длительности ее применения. Изучают содержание липидов и ЛП в сыворотке крови и липидов в печени, ХС в ткани аорты, степень пероксидации ЛПНП. Поскольку в основе патогенеза атеросклероза и желчекаменной болезни лежат одни и те же алиментарные факторы риска, то применение такой диеты позволяет изучать не только развитие атеросклероза, но и нарушения в системе гепатоэнтеральной циркуляции желчи и токсическое повреждение печени, что является предпосылками для развития желчекаменной болезни. Основными критериями для такой оценки являются скорость экскреции и состав желчи.
1.2.Оценка эффективности новых веществ
висследованиях на морских свинках
Висследовании используются самцы животных с массой тела 300–400 г, которым вводят 2 мл смеси ХС (0,5 г/кг) с жирами (свиной жир и предварительно прогретое подсолнечное масло, в соотношении 4:1) через зонд в ротовую полость. Продолжительность
исследований 16–18 дней. После 12–14 часового голодания животных помещают в СО2 камеру до потери сознания и эвтаназируют путем стерильного забора крови из полостей сердца. Содержание липидов определяют в сыворотке крови и печени, ЛП — в сыворотке крови. Кроме того, определяют степень пероксидации ЛПНП. У морских свинок в отличие от крыс и кроликов содержание a-ХС в сыворотке крови очень низкое и его трудно определить существующими методами.
1.3.Исследование гиполипидемического
иантиатеросклеротического действия новых веществ
в исследованиях на кроликах
Для изучения влияния новых соединений на липидный и ЛП состав крови в условиях гиперлипидемии, а также антиатеросклеротическое их действие необходимо проведение исследований на кроликах с исходной массой тела 2,8–3 кг, которым длительно (2–3 мес.) вводится ХС (0,3 г/кг) с пищей или в виде раствора в подсолнечном масле через зонд в желудок.
Спустя 1 месяц введения холестерина для усиления липидоза аорты в диету животных добавляют витамин D2 (эргокальциферол), раствор в масле 0,0625% в дозе 0,256 мл/кг на протяжении 30 дней.
С целью усиления склеротических изменений в аорте и снижения времени индукции атеросклероза, спустя 1 месяц от начала введения холестерина и на протяжении последующих 30 дней, каждые 5 дней животным вводят адреналин в дозе 0,04 мг/кг веса внутривенно (т.е. 6 инъекций).
В этих условиях, кроме выраженной гиперхолестеринемии и накопления атерогенных ЛП в крови, снижается содержание антиатерогенных ЛПВП. Происходит также увеличение содержания ХС и ТГ в печени и ХС в артериях (в частности в аорте). Кроме того, развивается атеросклеротическое поражение аорты (методом планиметрии регистрируется до 40–50% площади аорты, пораженной атеросклеротическими бляшками).
Данная модель гиперлипидемии и атеросклероза у кроликов, разработанная и описанная впервые академиком Н.И. Аничковым и сотр., широко применяется до настоящего времени при изучении гиполипидемического и антиатеросклеротического действия новых фармакологических веществ. Эти вещества вводятся на протяжении того же пе-
риода времени, что и ХС. Выясняется их влияние на содержание общего ХС, a-ХС, ТГ в сыворотке крови животных; на содержание ХС в аорте, липидов в печени и оценивается степень атеросклеротического поражения аорты.
При исследовании фармакологического вещества на кроликах количество животных в контрольной и получающих ЛС группах должно быть не менее 6. Это объясняется значительным индивидуальным разбросом липидных показателей у этих животных, а также наличием среди них особей, устойчивых к развитию экспериментальной гиперлипидемии и атеросклероза. Последние по мере выявления должны из исследования исключаться. Для сравнительного изучения активности нового соединения с известным выделяется дополнительная группа кроликов. Кроме того, необходимо выделить контрольную группу (интактные кролики). Желательно изучить действие нового препарата на липиды крови у интактных кроликов, то есть ввести еще одну группу животных. Кровь для исследования берется у кроликов через 12–18 ч голодания.
В случае если под влиянием изучаемого вещества будет установлена та или иная степень снижения атеросклеротического поражения аорты кроликов без существенного влияния на выраженность гиперлипидемии, то данное вещество, вероятно, может снижать ее проницаемость для атерогенных ЛП, т.е. быть похожим по механизму действия на перидинолкарбамат (продектин, пармидин). В зависимости от структурных особенностей исследуемого вещества уменьшение проницаемости аорты для атерогенных ЛП может быть обусловлено или его взаимодействием с атерогенными ЛП (образование комплекса, как это установлено при введении гепарина и структурно близких ему сульфатированных полисахаридов), или влиянием на метаболизм артериальной стенки. Отсюда вытекает необходимость изучения механизма действия подобных соединений с применением соответствующих методик, сравнение их гиполипидемической и антиатеросклеротической активности с известными препаратами.
Изучение механизмов действия новых эффективных веществ, оказывающих нормализующее влияние на нарушенный липидный и ЛП обмены и на развитие атеросклероза, способствует выяснению причин и условий этих нарушений, а также расширению показаний к их применению и созданию соединений с дифференцированным действием.
1.4.Изучение механизма действия новых веществ
сгиполипидемическим и антиатеросклеротическим действием
Для этих целей требуется проведение исследований in vitro и in vivo. Известно, что липолиз и липогенез в жировой ткани играют важную роль в липидном обмене, и угнетение липолиза является существенным в механизме гиполипидемического действия некоторых известных препаратов (например, никотиновой кислоты). В этой связи необходимо изучение липолиза в жировой ткани.
1.4.1.Изучение действия исследуемого вещества на липолиз
вжировой ткани в опытах in vitro (желательное исследование)
Вэтих опытах используется жировая ткань или жировые клетки придатка яичника взрослых крыс-самцов, которые инкубируются в специальной среде. Исследуемые вещества добавляются в среду инкубации в разных концентрациях, в зависимости от их химического строения. По интенсивности выделения в среду инкубации неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) или глицерина оценивается влияние нового вещества на липолиз. В качестве препарата сравнения применяется никотиновая кислота.
1.4.2.Изучение влияния нового вещества на концентрацию НЭЖК в крови
Концентрация НЭЖК в крови может служить отражением интенсивности липолиза
вжировой ткани. В исследование берутся крысы-самцы (170–200 г), которым для стиму-
ляции липолиза в жировой ткани вводится внутрибрюшинно адреналин (1,0–1,5 мг/кг). Через 30 мин после инъекции адреналина определяется уровень НЭЖК в плазме (сыворотке) крови. Испытуемые вещества вводятся перорально однократно за 1–2 ч до инъекции адреналина или предварительно в течение 3–5 дней (последнее введение — за 1–2 ч до инъекции адреналина). Учитывая дифференцированный характер аденилциклазных систем в жировой ткани желательно дополнительно исследовать влияние новых веществ на липолиз, вызванный введением адренокортикотропного гормона (АКТГ) и теофиллина.
1.4.3. Изучение связывания желчных кислот
Известно, что гиполипидемическое действие желчных секвестрантов осуществляется путем связывания в кишечнике желчных кислот (продуктов деградации ХС в печени) и выведения их из организма. Для определения способности нового соединения связывать желчные кислоты проводятся исследования in vitro.
К 2 мл 4%-ного водного раствора соли желчной кислоты (холата, гликохолата или таурохолата натрия) добавляется 100 мг испытуемого вещества, растворенного или суспендированного в 1 мл дистиллированной воды. После встряхивания в течение 15 мин и центрифугирования в супернатанте определяют количество соли желчной кислоты, не связанной изучаемым соединением.
1.4.4. Изучение связывания нового вещества с атерогенными липопротеидами
Известно, что гепарин и некоторые полярные полисахариды обладают способностью образовывать с атерогенными ЛП растворимые и нерастворимые комплексы, не проникающие в артериальную стенку. Если в процессе исследования специфической активности нового вещества возникает предположение о наличии у него способности связывать атерогенные ЛП, то желательно проведение соответствующих опытов in vitro. Для этих целей используется сыворотка крови гиперлипидемических животных или человека. К 0,2 мл сыворотки добавляется 2 мл 0,025 М раствора кальция хлорида. Исследуемое вещество (и для сравнения гепарин) вводятся в равных концентрациях (до 1%). Кроме того, как желательное исследование рекомендуется проведение исследований с применением выделенных ультрацентрифугированием ЛПНП (человека или животных). Раствор последних насыщают аммониевой солью 8-анилино-1-нафтолсульфонатом, обладающей способностью к флуоресценции. К раствору добавляют изучаемое вещество и по степени уменьшения флуоресценции судят об интенсивности связывания его с ЛПНП. В качестве сравниваемого соединения используется гепарин.
1.4.5. Изучение влияния новых веществ на показатели ПОЛ
Ускорению развития атеросклероза способствует накопление перекисных продуктов как в крови, так и особенно в атерогенных (апо-В-содержащих) ЛП, в основном в ЛПНП. Антиатеросклеротическое действие ряда препаратов во многом объяснятся их антиоксидантными свойствами. В этой связи можно рекомендовать изучение влияния новых веществ на показатели ПОЛ (диеновые коньюгаты, малоновый диальдегид) как в сыворотке крови, так и в атерогенных ЛП. Содержание продуктов ПОЛ увеличивается в условиях экспериментальной гиперлипидемии и дислипопротеидемии. Выделение апо- В-содержащих ЛП проводится с помощью описанных в литературе методов — ультрацентрифугированием или путем связывания и осаждения их из сыворотки крови гепарином в присутствии Mn2+.
1.4.6. Изучение влияния новых соединений на активность постгепариновой липолитической активности крови (липопротеинлипазы)
Если при исследовании нового вещества будет обнаружено выраженное снижение ТГ и ЛПОНП в крови животных, то для выяснения механизма его действия желательно
