камеру вносят тестируемое вещество в нарастающих концентрациях, на фоне которых воздействуют агонистом-анализатором. Если изучаемое вещество предотвращает или уменьшает эффекты агониста, можно полагать, что оно блокирует данные рецепторы.
Блокируя в сосуде синтез тех или иных метаболитов (например, простагландинов с помощью ацетилсалициловой кислоты в концентрации 10-4 М, время инкубации 40 мин), можно изучить их роль в действии веществ на сосудистый тонус. В тех случаях, когда имеет место необратимая блокада, необходимо использовать контрольную и опытные серии экспериментов.
Разрушая механическим способом эндотелий стенки сосудов перед помещением их инкубационную камеру, можно изучить его роль в реакции на вещество. Целостность эндотелия проверяют путем внесения в раствор на фоне К — контрактуры ацетилхолина (10-4 М), при разрушенном эндотелиальном слое реакция должна отсутствовать. Препарат отмывают и дают стабилизироваться в течение 1 ч. Затем проводят тестирование вещества.
Во всех сериях экспериментов рассчитывают показатель 50% эффекта препарата рА2 = -lg (С) [1].
Так как полученные в подобных опытах данные, как правило, не имеют нормального распределения, то для статистической обработки следует использовать непараметрические методы. Если сравниваются попарно-связанные выборки, то при 1 сравнении наиболее удобен метод знаковых рангов Уилкоксона, при 2 и более сравнениях используют непараметрический дисперсионный анализ по Фридману с дальнейшим применением множественных сравнений с помощью критерия Даннета или ранговых сумм Фридмана. В случае альтернативного учета данных (по типу возникла реакция — не возникла) следует использовать метод Мак-Нимара, учитывая при необходимости множественность сравнений. Если выборки независимые, то при 1 сравнении можно использовать критерий Манна-Уитни (или критерий Вилкоксона для независимых выборок), при 2 и более сравнениях следует использовать непараметрический дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису с последующей обработкой методом множественных сравнений по Данну. В случае альтернативного учета данных следует использовать метод точной вероятности Фишера, учитывая при необходимости множественность сравнений [15, 4, 9].
3.6. Исследование влияния вещества на адренореактивные структуры сердца
Для этой цели наиболее адекватным является использование препарата изолированного сердца лягушки по Штрабу. Этот метод дает возможность изучать действие веществ непосредственно на миокард, исключая нервные и гуморальные влияния со стороны организма, в то же время он достаточно прост и, в отличие от изолированных сердец теплокровных животных, не требует термостатирования и аэрации питательного раствора.
Препарат изготовляется следующим образом. Лягушку обездвиживают разрушением головного и спинного мозга с минимальными кровопотерями. Фиксируют брюшной стороной вверх. Обнажают сердце. Укрепляют на верхушке желудочка серфин (проволочный зажим). Далее производят следующие действия: 1) перевязывают правую дугу аорты; 2) под левую дугу аорты и луковицу аорты подводят лигатуры, не завязывая их; 3) сердце приподнимают за верхушку, закрепляют в подвешенном состоянии; 3) отдельно перевязывают правую и левую верхние полые вены, нижнюю полую вену; 4) одной лигатурой перевязывают легочные вены; 5) возвращают сердце в лежачее положение и завязывают одну из лигатур на левой дуге аорты как можно выше; 6) делают надрез в стенке луковицы аорты, вставляют заполненную раствором Рингера канюлю в левую дугу аорты, так чтобы ее носик проник в желудочек, закрепляют лигатурой. Сразу после закрепления канюли сердце промывают раствором Рингера. Затем, приподнимая сердце за канюлю, дистальнее лигатур перерезают сосуды и все ткани, связывающее сердце с организмом. Канюлю закрепляют в штативе, нитку серфина соединяют с тензорезисторным датчиком или рычаж-
ком Энгельмана (если запись будет производиться на ленте кимографа). Сердце еще раз промывают до полного обесцвечивания жидкости. Уровень жидкости в канюле должен быть постоянным в течение эксперимента (1/3–1/4 объема канюли) [6, 20].
Вэкспериментах используют раствор Рингера для холоднокровных следующего состава: NaCl — 102,6 мМ, KCl — 1,01 мМ, CaCl2 — 0,91 мМ, NaHCO3 — 1,19 мМ.
Висследованиях регистрируют амплитуду и частоту сокращений сердца. Протокол эксперимента выглядит следующим образом: проводят тестовую реакцию на адреналин (2–3 капли раствора в концентрации 10-6–10-5 г/мл), затем препарат отмывают и после восстановления показателей до исходного уровня вносят в раствор изучаемое соединение и на его фоне снова тестируют адреналином. Таким образом, выявляется наличие у вещества адреноблокирующих свойств. Если вещество оказывает прямой стимулирующий эффект на миокард, следует проверить наличие у него адреномиметического действия, с этой целью его вносят в перфузат на фоне β-адреноблокатора (например пропранолола), предварительно определив эффективные концетрации последнего с помощью тестирования адреналином. Проводят 6–8 исследований на серию.
Полученные результаты обрабатывают статистически, так же как описано в предыдущем пункте.
3.7.Изучение возможных антиаритмических свойств нового препарата
Используются аконитиновая, хлоридкальциевая, адреналиновая модели аритмий,
модель фибрилляции желудочков у крыс, модель аритмий у бодрствующих собак по Harris (см. Методические рекомендации по доклиническому изучению кардиотонической активности лекарственных средств).
Заключение
Приведенная программа поиска и доклинического изучения новых препаратов с предполагаемым противоишемическим действием включает большой комплекс исследований. В зависимости от результатов, полученных при первичной оценке препарата, исследователь уделяет более пристальное внимание отдельным методам исследований, наиболее важным для определения спектра и механизма действия препарата. При этом совсем не обязательно проводить все описанные исследования (особенно это относится к третьему этапу), следует отобрать наиболее информативные для данного конкретного случая. Так, если вещество практически не влияет на коронарный кровоток, скорее всего нет необходимости изучать его эффекты на препаратах изолированных сосудов. Чем тщательнее проведено доклиническое изучение, тем легче сформулировать показания к клиническому применению препарата. Информация, полученная в условиях эксперимента, дает возможность сделать правильный подбор больных, обеспечить оптимальные условия для выявления особенностей действия препарата, наметить меры профилактики осложнений, подобрать оптимальные дозы, способ применения и определить длительность курса лечения.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Блаттнер Р., Классен Х., Денерт Х., Деринг Х. // Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц. — М., Мир, 1983. — 206 с.
2.Вилкинсон Д. // Принципы и методы диагностической энзимологии.
3.Гацура В.В. // Фармакологическая коррекция энергетического обмена ишемизированного миокарда. — М.: Антекс, 1993. — 252 с.
4.Гланц С. // Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
5.Гурбанов К.Г., Ковалев Г.В., Паперно А.А. // Фармакол. и токсикол. — 1991а. — Т. 54, №4. —
С.21–23.
6.Каверина Н.В., Розонов Ю.Б., Чичканов Г.Г. // Современные аспекты антиангинальных средств. — М.: Медицина, 1980. — 240 с.
7.Карпман В.Л. // В кн.: Современные методы исследования функций сердечно-сосудистой системы, ред. Е.Б. Бабский, В.В. Парин. — М.: Медгиз, 1963. — С.125–141.
8.Келарева Н.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. и соавт. // Большой практикум по физиологии человека и животных. — М.: Высшая школа, 1984. — С. 187–270.
9.Кобзарь А.И. // Прикладная математическая статистика. — М.: Физматлит, 2006. — 813 с.
10.Кочетов Г.А. // Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высшая школа, 1980. — 272 с.
11.Метелица В.И. // Справочник по клинической фармакологии сердечно-сосудистых лекарственных средств. — М.: Медпрактика, 1996. — С. 54.
12.Нефедов В.П., Доррер Г.А., Ярыгина И.В. и соавт. // Параметры перфузии изолированных органов. — Новосибирск: Наука, 1983. — 229 с.
13.Сернов Л.Н., Соколова О.А., Бозиева Ж.Ч. // Бюл. Всес. науч. центра по безопас. биол. актив. веществ. — 1991. — №2. — С. 27–43.
14.Толмачева Е.А. // Новый антиаритмический препарат боннекор: некоторые аспекты фармакодинамики и фармакоинетики. — Дисс. ... канд. мед. наук. — М., 1988. — 144 с.
15.Холлендер М., Вулф Д.А. // Непараметрические методы статистики. — М.: Фининсы и статистика, 1983. — 518 с.
16.Цорин И.Б., Палка И.П., Чичканов Г.Г. // Эксперим. и клин. фармакол.. — 2009. — т. 72, №1. —
С.41–45.
17.Чичканов Г.Г., Боголепов А.К., Мациевский Д.Д. // Кардиология. — 1981. — т. 21, № 10. — С. 85–85.
18.Чичканов Г.Г., Цорин И.Б. // Фармакол. и токсикол. — 1985. — т. 48, № 2. — С. 49–54.
19.Шарлье Р. // В кн.: Результаты клинического изучения препарата кордарон: Материалы совместного советско-югославского симпозиума, посвященного клиническому изучению препарата «кордарон». — М., 1972. — С. 7–11.
20.Эндрю Б.Л. // Экспериментальная физиология. — М.: Мир, 1974. — 350 с.
21.Aono J., Akima M., Sakai K. // Jpn. J. Pharmacol. — 1981. — v. 31. — p. 823–830.
22.Boor B.J., Reynolds E.S. // Am. J. Clin. Pathol. — 1977. — v. 68. — p. 387–392.
23.Boudina S., Laclau M.N., Tariosse L. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. — 2002. — v. 282. — p. H821–H831.
24.Cosin J., Rivera M., Solaz J. et al. // Clin. Cardiol. — 1992. — v. 15. — p. 411–416.
25.Dai W., Hale S.L., Kay G.L. et al. // Cardiovasc. Thet.. — 2010. — v. 28. — p. 30–37.
26.Dorado D.G., Therous P., Elizaga L. et al. // Cardiov. Res.. — 1987. — v. 21, № 7. — p. 537–544.
27.Espinoza A., Halvorsen P.S., Ho L. et al. // Eur. J. Cardithorac. Surg. — 2010. — v. 37. — p. 119–126.
28.Fischer G. // Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. — 1989. — v. 339, Suppl. — p. 58.
29.Fischer G., Grohs J.G., Raberger G. // Cardiov. Res. — 1990. — v. 24. — p. 115–120.
30.Gout B., Jean J., Bril A. // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1992. — v. 262, №3. — p. 987–994.
31.Grover G.J., Schumacher W.A. // Basic Res. Cardiol. — 1989. — v. 84, № 1. — p.103–110.
32.Hamburger S.A., Barone F.C., Feuerstein G.Z. et al. // Pharmacology. — 1991. — v. 43, №3. — p. 113–120.
33.Igarashi Y., Aizawa Y., Tamura M. et al. // Amer. Heart J. — 1989. — v. 118, № 4. — p. 674–678.
34.Kanhei C.S., Sachin A., Goyal S. et al. // J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. — 2009. — v. 10. — p. 201–209.
35.Karasawa A., Kubo K., Shuto K. et al. // Arzneim. — Forsch. — 1988. — v. 38, № 11A. — p. 1702—1707.
36.Lacrouix P., Linee Ph., Le Polles J.B. // J. Pharmacol. and Exp. Ther. — 1978. — v. 204, № 3. — p. 645—654.
37.Lamar J.C., Constantin M., Dureny G., Tisne-Versailles J. //Br. J. Pharmacol. — 1983. — v. 79, Suppl. — p. 381.
38.Laslett L.J., Paumer L., Amsterdam E. A. // Circulation. — 1985. — v. 71. — p. 958—962.
39.Michael L.H., Entman M.L., Hartley C.J. et al. // Amer. J. Physiol. — 1995. — v. 269, № 6. — p. H2147–H2154.
40.Selye A.I., Bajuaz E., Crasse S. // Angiology. — 1960. — v. 11, № 5. — p. 398–407.
41.Szekeres L., Csik V., Udvary E. // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1976. — v. 196, № 1. — p. 15–28.
42.Vegh A., Szekeres L., Udvary E. // J. Mol. and Cell. Cardiol. — 1989. — v. 21, Suppl. № 2. — p.1.
43.White F.C., Roth D.M., Bloor C.M. // Basic Res. Cardiol. — 1989. — v. 84, № 1. — p. 42–54.
ГЛАВА 25
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ,
ВЛИЯЮЩИХ НА ЭНДОТЕЛИЙ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ
Составители: д. м. н., проф. О.Н. Щегловитова; Н.Н. Склянкина; к. вет. н. Н.А. Болдырева; к. м. н. А.А. Бабаянц; к. м. н. Д.Л. Беляев; И.С. Фролова; академик РАМН, проф. Ф.И. Ершов
Введение
Организм объединяется в единое целое с помощью системы кровеносных сосудов. Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, контактирует с кровью и обладает способностью получать и передавать биохимическую и физическую информацию в двух направлениях: в кровяное русло и вне его. Эндотелиальные клетки (ЭК) сосудов впервые были описаны в XIX веке, в начале XX века было обосновано представление об их секреторной функции, но только к концу XX века сформировалось представление об ЭК как динамичном, гетерогенном, диссеминированном органе с полифункциональными регуляторными потенциями [6, 9].
Общее количество ЭК у взрослого человека составляет 1–6×1013 клеток, при этом масса эндотелия составляет 1–2 кг и поверхность, занятая ЭК, — до 7 м2 . Эндотелий кровеносных сосудов является полупроницаемым барьером для крови, принимает участие в работе иммунной системы, контролирует тонус сосудов, обеспечивает ток крови, поддерживая антитромботический и фибринолитический фенотип [8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Эти и другие функции эндотелия реализуются с помощью факторов, экспрессируемых и синтезируемых клетками эндотелия сосудов (ЭС). Факторы, являющиеся маркерами функциональной активности эндотелия, обладают плеиотропными свойствами: один и тот же фактор, кроме проявления основного эффекта, оказывает влияние и на экспрессию факторов, регулирующих другие функции ЭС. Это связано с тем, что внутриклеточные механизмы трансдукции разных факторов имеют общие пути [6, 9].
ЭС вовлекается в патогенез инфекционных и соматических заболеваний. Большое число патогенов инфицирует эндотелий сосудов: это — вирусы группы герпеса, гриппа, арборвирусы, вирусы группы клещевого энцефалита, бактерии, в том числе хламидии [4, 6, 7]. Патогены вызывают развитие как острой, так и хронической формы инфекционного процесса в ЭС, что приводит как к временной, так и хронической дисфункции эндотелия. Дисфункция эндотелия является основой и результатом развития патологических процессов: рецидивирующего острого и хронического воспаления, тромбоза, нарушения тонуса сосудов, атеросклероза, васкулитов, отторжения трансплантированных органов, что происходит при многочисленных заболеваниях: острых и хронических вирусных инфекциях, ишемической болезни сердца, инфаркте, инсульте, диабете, метастазировании опухолей, нарушении зрения [6, 7, 9].
Фармацевтические препараты в организме попадают в кровоток и контактируют с эндотелием сосудов. Под воздействием препаратов клетки эндотелия продуцируют факторы — растворимые медиаторы, которые воздействуют на многочисленные звенья патогенеза инфекционных и соматических заболеваний.
1. ЭС обладает способностью под воздействием индукторов интерферона продуцировать интерферон, который вызывает в интактных клетках, в том числе и эндотелиальных, разви-
тие антивирусного состояния, предохраняющего клетки от инфицирования вирусами. Кроме этого интерферон способствует элиминации уже инфицированных клеток [2, 4, 5].
2.ЭС спонтанно и под влиянием иммуномодуляторов продуцирует широкий спектр цитокинов, включаясь таким путем в цитокиновую сеть организма, оказывает иммуномодулирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки и запускает каскад событий клеточного и гуморального иммунитета [3, 13].
3.ЭС принимает участие в развитии воспалительного процесса, направленного на элиминацию патогена из организма, путем обеспечения миграции иммунокомпетентных клеток крови в очаг воспаления. Эта функция ЭС реализуется под влиянием индукторов с помощью продукции цитокинов, активирующих на поверхности клеток эндотелия молекулы клеточной адгезии (МКА), которые соединяются с комплементарными молекулами на поверхности лейкоцитов крови, и хемокинов, способствующих трансэндотелиальной миграции лейкоцитов крови в очаг воспаления. Регуляция рекрутирования и миграции лейкоцитов осуществляется в том числе и с помощью растворимых МКА, отсоединяющихся в процессе развития воспаления с поверхности клеток эндотелия [8, 10, 11, 14, 16, 17].
4.Сосудистая гемодинамика в организме обеспечивается медиаторами, продуцируемыми ЭС: это медиаторы, регулирующие кровяное давление — вазодилятаторы и вазоконстрикторы. Кроме этого, эти медиаторы принимают участие в развитии воспалительного процесса, при котором продукция вазодилятаторов, с одной стороны, приводит к локальному расширению сосудов, но, с другой стороны, способствует локализации лейкоцитов и увеличению их миграции в очаг воспаления. Действие вазоконстрикторов оказывает противоположное действие на течение воспалительного процесса [4, 6, 9].
5.Сосудистая гемодинамика зависит от факторов, осуществляющих образование и рассасывание тромба. Клетки эндотелия сосудов в тельцах Вейбель-Паллада содержат фактор вон Виллебранда. Активированные клетки ЭС выделяют этот фактор, и его действие совместно с другими факторами крови приводит к образованию тромба в кровеносном сосуде [9].
6.ЭС обладает способностью синтезировать металлопротеиназу — фермент, действие которого направлено на разъединение клеток эндотелия в капиллярах, их размножение и образование новых сосудов. Ангиогенез является важным позитивным фактором при репаративных процессах. Однако ангиогенез при опухолевом процессе способствует росту опухоли и ее метастазированию [6, 9, 15].
В настоящих методических рекомендациях предлагается комплексное изучение фармпрепаратов, дающее возможность оценить их интерфероноиндуцирующие, иммуномодулирующие и антивирусные свойства на новой модели: первичной культуре эндотелия кровеносных сосудов, что адекватно отражает реальную ситуацию в организме. Кроме этого исследования дают возможность выявить корреляцию между вышеперечисленными свойствами препаратов и специфическими для эндотелия сосудов свойствами: про- и антивоспалительными, регулирующими кровяное давление, влияющими на тромбообразование и ангиогенез.
1.Общие положения
1.1. Понятия и термины
Интерферониндуцирующая активность — способность препарата индуцировать в культуре клеток эндотелия продукцию интерферона: вещества, обладающего антивирусыми свойствами.
Противовирусная активность — способность препарата ингибировать в культуре клеток эндотелия репродукцию вируса.
Иммуномодулирующая активность — способность препарата активировать или ингибировать продукцию цитокинов культурой клеток эндотелия.
Про- и противовоспалительная активность — способность препарата активировать в культуре эндотелия продукцию провоспалительных цитокинов, которые активируют
экспрессию молекул клеточной адгезии (МКА) на эндотелии и запускают рекрутирование лейкоцитов крови при воспалении.
Регуляция кровяного давления — способность препарата активировать в культуре эндотелия продукцию вазодилятатора (оксида азота ) и вазоконстриктора (эндотелина-1), которые также оказывают влияние на воспалительные процессы в стенке кровеносных сосудов: подавление и активацию соответственно.
Регуляция тромбообразования — способность препарата влиять на продукцию культурой эндотелия фактора вон Виллебранда, который также включается в процесс развития и завершения воспаления.
Регуляция ангиогенеза — способность препарата влиять на продукцию культурой эндотелия матриксной металлопротеиназы-1, которая также включается в репаративные процессы при воспалении.
2.2. Цели и задачи исследования
Целью исследования является изучение свойств фармпрепаратов, связанных с их воздействием на функциональное состояние эндотелия кровеносных сосудов.
Задачи исследования заключаются в оценке интерферониндуцирующего, иммуномодулирующего и противовирусного действия фармпрепаратов на новой модели первичной культуры эндотелия кровеносных сосудов и взаимосвязи этих активностей со специфическими для эндотелия сосудов свойствами: про- и антивоспалительными, регулирующими кровяное давление, влияющими на тромбообразование и ангиогенез.
2.3.Основные этапы исследования
1.Получение культуры эндотелия кровеносных сосудов и ее культивирование.
2.Засев культуры на 24 луночные планшеты и ее культивирование.
3.Внесение исследуемого препарата в свежей культуральной среде в лунки с монослоем клеток эндотелия для исследования:
А.интерферона, цитокинов, растворимых МКА, оксида азота, эндотелина-1, фактора вон Виллебранда, матриксной металлопротеиназы-1; Б. антивирусного действия препарата.
В контрольных лунках разделов а) и б) необходимо только менять среду, не внося препарат.
4.А. Отбор культуральной среды в динамике: через 24, 48 и 72 ч и хранение образцов до проведения исследования при температуре –20 °С.
Б.После 24 ч культивирования клеток с препаратом и без него внесение в свежую культуральную среду вируса простого герпеса 1 типа и отбор образцов в динамике — через 24, 48 и 72 ч, которые сохраняют до проведения исследования при температуре –20 °С.
5.А. Тестирование в отобранных образцах вышеперечисленных факторов.
Б.Тестирование в образцах содержания инфекционного вируса.
2.4. Тесты и биологические модели
Все исследования выполняются в первичной культуре клеток эндотелия кровеносных сосудов человека. Наиболее доступной и удобной моделью для работы с эндотелием кровеносных сосудов является первичная клеточная культура, получаемая из вены пупочного канатика человека (ЭКПВЧ) [1, 11]. Культуру используют на уровне первого пассажа, так как только в этом случае сохраняется исходный фенотип клеток. Для тестирования растворимых медиаторов необходимо использовать тест-системы и выполнять дополнительное исследование содержания интерферона биологическим методом. Для тестирования инфекционной активности ВПГ-1 необходимо использовать культуру клеток почек зеленой мартышки VERO.
Все отобранные образцы культуральной среды тестируют методом иммуноферментного анализа (ИФА) в специфических тест-системах («Вектор-Бест», «Протеиновый
контур», «Biosource», «Bender Medsystems»). Уровень активности интерферона определяют в биотесте в культуре диплоидных фибробластов человека. Инфекционный титр вируса определяют в культуре почек зеленых мартышек VERO по развитию цитопатического действия.
2.5. Условия проведения исследования
Эндотелиальные клетки выделяют с помощью фермента диспазы (Sigma) из вен пупочных канатиков, полученных от здоровых женщин после нормальных родов, и культивируют в инкубаторе при температуре 37 °С с 5% СО2 на пластиковой посуде в ростовой среде, состоящей из среды 199 (Gibco), 2 мM L-глютамина, гепарина (5 ед/мл), 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone), гентамицина (50 мкг/мл), фактора роста эндотелия (100 мкг/мл). После образования монослоя клетки диспергируют раствором ТрипсинЭДТА (GIBCO) и засевают на 24 луночные плата из расчета 120000 клеток в 1 мл на лунку. На 4 день после образования монослоя в лунки в свежей среде роста вносят исследуемый препарат в разных концентрациях. В контрольных лунках только меняют среду роста. В динамике культивирования отслеживают токсический эффект препарата на клетки и отбирают пробы культуральной среды, которые хранят при температуре –20°С до тестирования. Для исследования развития антивирусного состояния на 4-й день после образования монослоя в лунки в свежей среде роста вносят исследуемый препарат в разных концентрациях, в контрольные лунки вносят только свежую среду без препарата. После 24 ч культивирования клеток среду декантируют и в свежей среде роста вносят вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) с множественностью инфицирования 0,001 инфекционных единиц на клетку (ТЦД50) — в лунки, в которые был внесен препарат и в контрольные без препарата. В динамике культивирования оценивается развитие цитопатического действия вируса и отбирают пробы культуральной среды, которые хранят при температуре –20 °С для исследования на содержание инфекционного вируса. Все исследования выполняются на не менее чем 4 культурах эндотелия, полученных от разных доноров.
На этой модели была определена способность ряда препаратов индуцировать интерферон, цитокины, растворимые медиаторы — маркеры, характеризующие основные проявления функциональной активности эндотелия сосудов, а также вызывать развитие антивирусного состояния.
1.Маркер антивирусной активности — интерферон.
2.Маркеры иммуномодулирующей активности — цитокины.
3.Маркеры воспалительного процесса:
а) цитокины, б) молекулы клеточной адгезии.
4.Маркеры регуляции тонуса сосудов — оксид азота и эндотелин-1.
5.Маркер коагулянтной активности — фактор вон Виллебранда.
6.Маркер ангиогенеза — матриксная металлопротеиназа 1 типа.
7.Развитие антивирусного состояния — подавление репродукции вируса простого герпеса 1 типа.
2.6.Оборудование, инструменты и реактивы
1.Оборудование:
—СО2 инкубатор;
—центрифуга низкоскоростная;
—мультискан;
—шейкер с терморегуляцией;
—вошер;
—водяная баня.
2. Инструменты:
—конюли стеклянные диаметром 6 мм;
—соединительные силиконовые трубки диаметром 8 мм;
—пипетки автоматические с постоянным или переменным объемом;
—шприцы 10 мл;
—ножницы;
—пинцеты;
—корнцанги;
—марлевые салфетки;
—шпагат;
—флаконы пластиковые стерильные для выращивания клеток;
—пробирки пластиковые стерильные объемом 10 мл и 50 мл;
—планшеты пластиковые культуральные стерильные 24-луночные;
—планшеты пластиковые культуральные стерильные 96-луночные;
—чашки Петри пластиковые, диаметром 10 см;
—парафильм;
—флаконы стерильные 0,5 л;
—наконечники к автоматическим пипеткам стерильные.
3. Реактивы:
—среда 199 (Gibco);
—физиологический раствор;
—среда RPMI-1640;
—L-глютамин 2 mM;
—гепарин;
—сыворотка эмбрионов коров (HyClone);
—гентамицин;
—фактор роста;
—диспаза (Sigma);
—трипсин-ЕДТА (GIBCO).
2.7. Растворители и разбавители
Для растворения исследуемого образца необходимо использовать растворители, заявленные создателями препарата. В качестве разбавителя необходимо использовать как растворители, заявленные создателями препарата, так и среду роста клеток эндотелия.
2.8. Дозы, пути и режимы введения
При исследовании активности препарата доза вводимого в культуру препарата определяется токсичностью препарата и должна быть меньше токсической для культуры дозы. Препарат вводится в среде роста за 24 ч до введения вируса при исследовании интерферониндуцирующего и антивирусного действия препарата и за 24 ч до отбора материала для выполнения остальных исследований.
2.9. Продолжительность исследования
Исследование выполняется в течение 3 недель.
2.10.Рекомендации по выбору препарата сравнения
Вкачестве препарата сравнения для характеристики интерферониндуцирующих и антивирусных свойств препарата может быть использован препарат эрбисол, для характеристики остальных свойств препарата может быть использован рекомбинантный интерферон гамма человека.
3.Исследование интерферониндуцирующей активности лекарственных средств, влияющих на эндотелий кровеносных сосудов
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата индуцировать в культуре ЭКПВЧ продукцию интерферона. Задача эксперимента заключается в опреде-
лении дозы препарата, индуцирующей максимальную продукцию интерферона ЭКПВЧ. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ВБН в среде роста (контроль индукции интерферона — ИФН) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5% СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20 °С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание ИФН общепринятым методом в культуре диплоидных фибробластов человека (ДФЧ), засеянных на 96 луночные планшеты, по торможению развития цитопатического действия 100 ТЦД50 инфекционных доз вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭММ). Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Уровень ИФН выражают в единицах, обратных последнему разведению образца, тормозящего на 50% развитие цитопатического действия ВЭММ. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в ЕД/мл вместе с результатами, полученными при исследовании контроля индукции ИФН (ВБН).
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать интерферониндуцирующую активность препарата в культуре ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на возможность защиты этим препаратом эндотелия сосудов и других клеточных систем организма от вирусного инфицирования.
4. Исследование противовирусной активности лекарственных средств, влияющих на эндотелий кровеносных сосудов
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата тормозить репродукцию ВПГ-1. Задача эксперимента заключается в выявлении оптимальной дозы препарата, ингибирующей репродукцию ВПГ-1. Каждую из четырех культур ЭКПВЧ, полученных от разных доноров, засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в среде роста в одну лунку. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В две лунки каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37°С с 5% СО2 среду из всех лунок удаляют и в лунки, инкубировавшиеся с препаратом, и в одну контрольную лунку каждого типа клеток вносят ВПГ-1 с множественностью инфицирования 0,001 ТЦД50/клетку в среде роста; в контрольные лунки вносится только среда. В динамике культивирования клеток: через 24, 48 и 72 ч отбирают образцы культуральной среды и хранят до тестирования при температуре –20°С.
Для тестирования инфекционной активности вируса в 96-луночные плата засевают культуру клеток почек зеленой мартышки VERO из расчета 100 тыс клеток/мл. После культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5% СО2 среду из всех лунок удаляют и в лунки вносят последовательные десятикратные разведения образцов. Учет результатов осуществляется на 4 день культивирования клеток VERO. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Инфекционную активность вируса выражают в обратных десятичных логарифмах. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента. Антивирусную активность препарата представляют в виде разницы между титром вируса в контрольных, не обработанных препаратом ЭКПВЧ, и титром вируса в ЭКПВЧ, обработанных минимальной и максимальной дозой препарата.
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать антивирусную активность препарата в культуре ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кро-
веносных сосудов в организме — и указывают на возможность защиты этим препаратом эндотелия сосудов и других клеточных систем организма от вирусного инфицирования.
5. Исследование иммуномодулирующей активности лекарственных средств, влияющих на эндотелий кровеносных сосудов
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата индуцировать или ингибировать в культуре ЭКПВЧ продукцию цитокинов. Задача эксперимента заключается в определении дозы препарата, оказывающей индуцирующий или ингибирующий эффект на продукцию цитокинов ЭКПВЧ. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ИФН гамма (1×104 МЕ/мл) в среде роста (контроль иммуномодулирующего действия) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37 °С с 5% СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20 °С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание цитокинов
втест-системах. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Уровень цитокинов в исследовании выражают в процентах относительно уровня цитокинов в контроле. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в процентах вместе с результатами, полученными при использовании контроля индукции цитокинов (ИФН гамма).
Результаты, полученные в эксперименте, дают возможность оценивать иммуномодулирующую активность препарата в культуре ЭКПВЧ и в более широком смысле — в эндотелии кровеносных сосудов в организме и указывают на участие эндотелия сосудов
всистеме иммуномодуляции в организме.
6.Исследование про- и противовоспалительной активности
лекарственных средств, влияющих на эндотелий кровненосных сосудов
Цель эксперимента заключается в выявлении способности препарата индуцировать в культуре ЭКПВЧ продукцию провоспалительных цитокинов, которые активируют экспрессию молекул клеточной адгезии (МКА) на эндотелии и запускают рекрутирование лейкоцитов крови при воспалении.
Задача эксперимента заключается в определении дозы препарата, индуцирующей максимальную и минимальную продукцию цитокинов ЭКПВЧ и максимальное и минимальное отщепление МКА. Культуру ЭКПВЧ засевают в 6 лунок 24-луночного планшета из расчета 120 тыс. клеток в мл в одну лунку. Засевают сразу четыре культуры, полученные от разных доноров. На 4 день после образования монослоя среду из лунок удаляют и вносят в 4 лунки каждого типа клеток последовательные разведения исследуемого вещества в среде роста. В одну лунку каждого типа клеток вносят ИФН гамма (1×104 МЕ/мл) в среде роста (контроль продукции цитокинов и отщепления МКА) и в одну лунку каждого типа клеток вносят только среду роста (контроль). После 24 ч культивирования клеток в СО2 инкубаторе при температуре 37°С с 5% СО2 отбирают пробы культуральной среды, которые хранят до тестирования при температуре –20°С.
Отобранные образцы культуральной среды тестируют на содержание цитокинов и растворимых (отщепившихся) МКА в тест-системах. Эксперимент продолжается в течение 3 недель. Содержание всех показателей в исследовании выражают в процентах относительно уровня этих же показателей в контроле. Результаты 4 экспериментов обрабатывают статистически по методу Стьюдента и представляют в процентах вместе с результатами, полученными при использовании контроля индукции цитокинов и отщепления МКА (ИФН гамма).
