F55 - F78 .

Zur Hausen H. Molecular pathogenesis of cancer of the cervix // Topics in Microbi­ ology and Immunology / ed. H. zur Hausen. — Berlin: Springer, 1994. — Vol. 186. - P. 136-157.

Zur Hausen H. Papilloma virus causing cancer: evasion from control in early events of carcinogenesis // J. Nat. Cancer Inst. — 2000. - Vol. 92. - P. 690 - 698 .

Phillips A. C, Vousden К. H. Human papillo­ maviruses and cancer // Viruses and hu­

5.4. Роль вируса гепатита в развитии рака печени

Ф. Л. Киселев

Можно считать установленным, что около 15 % опухолей человека этиологически связаны с наличием в них вирусного генетического материа­ ла. Среди таких опухолей 30 % прихо­ дится на рак печени, ассоциирован­ ный с вирусами гепатита В и С (HBV и HCV соответственно), что составля­ ет 4,5 % от всех известных опухолей.

Эпидемиологические данные сви­ детельствуют о том, что у мужчин с хронической инфекцией вирусами ге­ патита В и С риск возникновения опухоли возрастает почти в 100 раз. Наиболее четкие эпидемиологические данные получены в отношении вируса гепатита В. Существует четкая географическая корреляция между присутствием основного антигена это­ го вируса (HbsAg) и частотой возник­ новения гепатита печени (НСС). В настоящее время на земном шаре ин­ фицированы около 200 млн человек;

каждый год в результате заражения HBV погибают 2 млн заболевших, из которых 700 тыс. человек умирают от рака печени, ассоциированного с HBV. Хотя в настоящее время активно внедряется вакцина против HBV, по подсчетам ВОЗ, к 2000 г. более 400 млн людей остаются хронически инфицированными. Поскольку инку­ бационный период для HBV-ассоции- рованного рака печени составляет не менее 30 лет, можно полагать, что опухоли печени будут представлять серьезную проблему для здравоохра­ нения еще многие десятилетия.

Не менее сложна и ситуация с ви­ русом гепатита С. В настоящее время только в СШ А инфицировано 3,9 млн человек, из которых хронически ин­ фицировано 2,7 млн. Ситуация скла­ дывается таким образом, что в тече­ ние последующих 20 лет количество HCV-инфицированных может возрас­ ти в 3 раза, что в свою очередь увели­ чит риск возникновения опухолей пе­

один и тот же тип опухолей индуци­ руется как ДНК-содержащим (HBV), так и РНК-содержащим (HCV) ви­ русом.

Активные исследования роли HBV

вэтиологии рака печени были начаты

в1970 г., когда был клонирован геном этого вируса и выявлено очень сход­ ное заболевание у земляных сурков: выделенный от них вирус гепатита по всем параметрам был сходен с HBV и вызывал опухоли печени у 100 % ин­ фицированных животных.

ВHBV-позитивных опухолях ви­ русная Д Н К , как правило, интегриру­ ется в клеточный геном, и такие клет­ ки активно пролиферируют. Индиви­ дуальные опухоли являются моноклональными по типу интеграции вирус­ ной ДНК . При этом интеграция не имеет специфического сайта в клеточ­ ном геноме и может происходить в различных его участках без каких-ли-

бо закономерностей, в связи с чем представляется маловероятным пред­ положение о прямой активации (цис­ активации) определенных клеточных генов в результате интеграции вирус­ ного генома. До сих пор не удалось идентифицировать какого-либо гепа- тоцит-специфического онкогена, ко­ торый узнавался бы HBV.

Более естественным представля­ лось предположение о транс-активи- рующем потенциале генома HBV. В настоящее время в составе генома HBV идентифицировано несколько генов, продукты которых обладают способностью активировать транс­ крипцию других генов. Это продукты так называемого гена X (НВх) и гена PreS2 в форме крупного поверхност­ ного белка LHBs и в форме белка, ре­ дуцированного по С-концу, MHBs(t) (схема 5.8). При этом экспрессия про­ дуктов НВх и LHBs возможна с ин - тактного вирусного генома, в то время как кодирующая рамка MHBs(t) — только после разрыва кольцевой мо­ лекулы Д Н К HBV и ее интеграции в клеточный геном.

транскриптазу), а также ТБ, ассоции­ рованный с минус-нитью Д Н К . O R F С (на схеме nucleocapsid) кодирует структурный белок нуклеокапсида (НВс), a O R F S/preS (на схеме preS, + preS2 + surface) — гликопротеиды оболочки вириона. O R F X кодирует специфический белок в 17 кДа, обла­ дающий транс-активирующими по­ тенциями . O R F S/preS может коди­ ровать несколько белков, наиболее крупный из них (L) имеет молекуляр­ ную массу 39 кДа, другой — 31 кДа. Оба белка имеют общий S-домен и отличаются по размеру и структуре своего Ν - домена. Классический Н В - sAg содержит только S-домен. Белки L и М, кодируемые pre-S-участком, составляют незначительную часть циркулирующих S-родственных ан­ тигенов (для М-белка — 5—10 %, для белка L - 1-2 % ) .

Репликация происходит через прегеномную РНК-матрицу, что сближа­ ет гепаднавирусы с ретровирусами. Вирус обладает высоким уровнем видо- и тканеспецифичности.

Как правило, вирусная Д Н К в

5.4.1. Геном вируса гепатита В

Геном вируса гепатита В, относя­ щегося к группе гепаднавирусов, име­ ет ряд характерных особенностей. Его Д Н К размером 3200 пар оснований является частично двунитевой (см. схему 5.5). Структура необычна тем, что нити Д Н К несимметричны — ми­ нус-нить является полноразмерной и на 5'-конце с ней ковалентно связан так называемый терминальный белок (ТБ). Плюс-нить существенно короче и на 5'-конце заканчивается олигорибонуклеотидом. На 5'-концах каждой из нитей имеются 11-членные нуклеотидные повторы.

В составе Д Н К идентифицирова­ но 4 открытые рамки считывания (ORF). Ген Ρ (на схеме primer + polymerase + Rnase Η) кодирует соб­ ственный фермент — РНК-зависи­ мую ДНК - полимеразу (обратную

С х е м а 5.8. Генетическая структура ви­

руса гепатита В

3189

LHBs и MHBs(t)

НВх и LHBs обладают конститу­ тивными транс-активирующими свойствами, в то время как у MHBs(t) (MHBs, редуцированный по С-концу) эти свойства проявляются только по­ сле делеции З'-концевой области гена preS/S, которая происходит в резуль­ тате рекомбинации вирусной и кле­ точной Д Н К в процессе интеграции. Активация под действием LHBs и MHBs(t) базируется на одних и тех же структурных элементах (домен pre-S2) и вовлечена в одни и те же пути пере­ дачи сигнала.

Ген preS/S содержит одну откры­ тую рамку считывания, которая разде­ лена на 3 кодирующих участка — PreSl, PreS2 и S, каждая из которых инициируется с внутреннего A T G - K O - дона. В результате альтернативной инициации могут синтезироваться 3 гликопротеида оболочки — крупный (LHBs, PreSl + PreS2 + S), средний (MHBs; PreS2 + S) и мелкий (SHBs; S), все 3 гликозилированы по амино­ кислоте 146 внутри участка S. MHBs дополнительно гликозилируется по аспарагину в 4-й позиции в области PreS2 и может выявляться в негликозилированной (р30), моногликозилированной (gp33) и бигликозилированной формах (gp36). MHBs содержит 3 гидрофобных участка, входящих в со­ став трансмембранного домена. MHBs синтезируется как нейтральный мем­ бранный белок, который секретируется в эндоплазматический ретикулум (ЭР) и аппарат Гольджи (АГ). Если MHBs экспрессируется с вирусного генома, то он образует смешанные частицы с SHBs и LBHs в липидной оболочке.

Активатор MHBs(t) был впервые выявлен во многих культивируемых клетках гепатом и может быть обнару­ жен и в опухолях печени, содержащих интегрированный геном HBV.

Детальный анализ клонированной Д Н К HBV показал, что активирую­ щий потенциал возникает в результате

3'-области гена preS2/S. Эта делеция касается последовательностей, коди­ рующих гидрофобный участок III, в основном 70 С-концевых аминокис­ лот. Участок pre/S1 не является обяза­ тельным для проявления транс-акти- вирующих функций MHBs(t). Экспе­ рименты по контрансфекции показа­ ли, что эти функции теряются при му­ тации со сдвигом рамки по позиции 129 (аминокислота 47), а отрезание ге­ нома по нуклеотиду 221 (аминокисло­ ты 76) приводит к образованию функ­ ционального MHBs(t) транс-актива- тора.

MHBs(t), по-видимому, локализу­ ется в ЭР и не способен процессироваться в АГ и затем секретироваться. В этом, по-видимому, заключается принципиальное отличие MHBs и MHBs(t). Белки MHBs(t), утерявшие все 3 трансмембранных домена, также обладают транс-активирующими функциями, но они не связаны с мем­ бранами ЭР и гомогенно распределе­ ны по цитоплазме и ядру.

Таким образом, существуют 2 типа MHBs(t) транс-активаторов, один из которых локализуется в ЭР, а второй диффузно распределенный по клетке. В отличие от полноразмерного MHBs оба субтипа имеют одно общее свой­ ство, состоящее в том, что их preS2 домены экспонированы в цитоплазму. Еще одно отличие MHBs(t) от полно­ размерного MHBs состоит в том, что MHBs(t) может подвергаться фосфорилированию под действием РКС .

MHBs(t) — зависимая транскрип­ ционная активность — является плейотропной, и достаточно широкий спектр различных мишеней-последо­

Bs(t)-aктиватopoв не выявляют разли­ чий по их специфичности и активи­ рующему потенциалу. Эта активность не является тканеили видоспецифической. Поскольку MHBs(t) не спосо­ бен связываться непосредственно с Д Н К или с ДНК-связующими белка­ ми и проявляет свой эффект путем

активации различных неродственных транскрипционных факторов, таких как AP1, АР2, NF - KB и SP1, можно предполагать, что MHBs(t), как и НВх, интерферируются с ранними процессами в пути передачи клеточ­ ного сигнала.

С помощью специально разрабо­ танных экспериментальных подходов удалось установить, что РКС являют­ ся специфическими партнерами свя­ зывания и играют ключевую роль в МНВs(t)-зависимой транскрипцион­ ной активации. Кроме того, оказа­ лось, что MHBs(t) активирует РКС независимо от 1,2-диацилглицерина (DAG). Следовательно, MHBs(t) пред­ ставляет собой новый тип индуктора РКС. МНВs(t)-зависимая активация РКС является необходимой для М Н - Bs(t)-ассоциированной активации AP1 и NF-KB. При этом также показано, что эта активация в отличие от HBs запускается независимо от онкогена Ras 1 и сопровождается активацией клеточных киназ c-Raf и МАР2. Сово­ купность этих данных позволяет пред­ положить следующую модель М Н - Bs(t)-опосредованной транскрипцион­ ной активации: MHBs(t) связывается с РКС, индуцируя ее активацию, не зависимую от DAG. Активация РКС передается через c-Raf-1 и МАР2 киназы в ядро и в итоге приводит к ак­ тивации транскрипционных факто­

ров AP1 и N F - K B .

5.4.4. Роль хронической инфекции HBV для развития опухолей печени

Выше отмечалось, что на основа­ нии эпидемиологических данных бы­ ло высказано предположение о том, что H B V играет ключевую роль в раз­ витии гепатом, которое получило серьезное подтверждение после выяв­ ления вирусной Д Н К в этих опухолях. В настоящее время существует еще одна группа данных, подтверждающих это положение.

С 1970 г. началась регулярная вакцинация людей против HBV, и, по

предварительным данным, в этой по­ пуляции отмечается снижение часто­ ты рака печени, однако однозначных конкретных результатов, видимо, ожидать после 2005 г.

Не надо забывать, что HBV не содержит собственного онкогена и опу­ холевый процесс проявляется через очень длительный период после первичной инфекции (до 30 лет), что свидетельствует о многостадийности процесса. При этом совершенно не­ понятно, играет ли HBV ключевую роль на одном или на нескольких I критических этапах.

Подавляющее большинство боль­ ных с HBV-ассоциированными опухо­ лями являются позитивными по ос­ новному вирусному антигену HBsAg. Представленные выше данные позво­ ляют предполагать, что экспрессия LBHs (транскрипционного активато­ ра) может иметь важное значение в развитии опухоли, однако существую­ щими ныне методами экспрессию LBHs выявить не удалось. В свою оче­ редь это может быть связано с не­ сколькими обстоятельствами:

•используемые методы недоста­ точно чувствительны для выяв­ ления весьма малых количеств LBHs;

•функция LBHs необходима толь­ ко на ранних стадиях развития гепатом;

•его функции на поздних этапах опухолевой прогрессии переда­ ются НВх или MHBs(t).

При изучении экспрессии различ­ ных рамок считывания было обнару­ жено, что активируются рамки, коди­ рующие НВх или MHBs(t) — транс- активаторы, стимулирующие пути пе­ редачи сигналов, т. е. те пути, кото­ рые активируются опухолевыми про­ моторами типа ТРА, как это имеет место и при химическом канцерогене­ зе. В связи с этим можно предпола­ гать, что опухолевая промоция, осу­ ществляемая в данном случае за счет HBV, может быть первичным факто­ ром инициации онкогенеза.

Не менее важным является вопрос о возможном участии опухолевого ге- на-супрессора р53 в развитии гепатом. Существуют противоречивые данные о взаимодействии НВх и MHBs(t) с р53. Анализ состояния р53 в гепатоцеллюлярных раковых опухолях пока­ зал, что мутации в этом гене проявля­ ются только в опухолях тех больных, которые содержат Д Н К HBV или под­ вергались воздействию афлатоксина. Возможно, что появление мутаций в гене р53 является независимым про­ цессом и не связано с HBV.

фактически уходят из-под иммуноло­ гического контроля, поскольку именно эти антигены являются мишенями для иммунного ответа. В результате этого происходит селекция клеток с интегри­ рованной Д Н К HBV, кодирующей 3 основных транс-активатора — НВх, LНВ-и/или MHBs(t). Возможно (и это может бытъ важным моментом), эти транс-активаторы могут активировать не только гены, контролирующие про­ лиферацию клеток, но и ряд других ге­ нов и прежде всего генов цитокинов, в частности интерлейкина-6 (IL-6). Эти цитокины, секретируемые из транс-ак­ тивированных клеток, могут создавать специфическое микроокружение со­ седствующих фибробластов, эндотелиальных и других клеток, что приводит

к освобождению из этих клеток других ростовых факторов, например инсулиноподобный ростовый фактор II, кото­ рый в свою очередь стимулирует по паракринному типу пролиферацию транс-активируемых гепатоцитов. Эта новая эпигенетическая ситуация может способствовать проявлению дальней­ ших процессов в канцерогенезе, таких как мутации, хромосомные аберрации, которые будут способствовать селек­ ции клеток с ускоренной полиферацией за счет транс-активирующих потен­ ций вирусных генов.

Необходимо подчеркнуть, что, кроме возможной этиологической ро­ ли HBV в гепатоканцерогенезе, в опу­ холевых клетках выявлены многие мо- лекулярно-генетические изменения, характерные и для развития опухоле­ вых процессов в других органах. Наи­ более частыми событиями в опухолях печени являются делеции или инакти­ вация таких опухолевых супрессоров, как р53, Rb, BRCA 2 и Е-кадхерин. Среди других факторов следует отме­ тить активацию теломеразы на пред­ раковых стадиях в карциномах и дерегуляцию факторов, участвующих в сигнальных путях, контролируемых Wnt и MAPK/ERK.

Такая схема не только может объ­ яснять длительный латентный период, но и позволяет предполагать, что про­ цесс в каждом индивидуальном случае протекает по своему собственному плану. В результате этого каждая опу­ холь должна иметь свой генетический портрет, т. е. различные типы мута­ ций и хромосомальных реаранжиро­ вок. Подобная индивидуализация гепатоцеллюлярных карцином ставит серьезнейшие вопросы для создания эффективных терапевтических прото­ колов, и это задача будущего.

5.4.5. Геном вируса гепаmuma С

Вирус гепатита С относится к се­ мейству Flaviviridae и его геном пред­ ставлен однонитевой РНК, содержа­ щей 9033 нуклеотида, которые спо-

собны кодировать ~3000 аминокислот (схема 5.9). Функционально геном мо­ жет быть разделен на 2 участка, один из которых кодирует 3 белка вириона, из них 2 представлены белками обо­ лочки, а один составляет ядро вирио­ на; другой участок генома может ко­ дировать несколько белков, обладаю­ щих важными ферментативными свойствами. Среди них металлопро­ теаза, еще один протеолитический фермент, хеликаза, РНК-зависимая РНК-полимераза и один из кофакто­ ров протеазы. Какова роль этих фер­ ментов в абортивном цикле размно­ жения вируса (включая роль в канце­ рогенезе), — в настоящее время неиз­ вестно. Следует также отметить, что на обеих концах вирусной Р Н К име­ ются регуляторные последовательно­ сти (UTR), и Р Н К HCV в этом плане напоминает РН К ретровирусов.

Остается неясным, в какой форме РНК HCV персистирует при хрониче­ ской инфекции (и в опухолях печени тоже). Серологические методы на бел­ ки оболочки или ядра вирусной час­ тицы не являются адекватными, но при этом вирусная Р Н К регулярно выявляется в опухолях с помощью RT-PCR. Никаких доказательств об­ ратной транскрипции Р Н К HCV не получено и, таким образом, форма персистенции вирусной Р Н К остается неясной. Отсутствие адекватных кле­

точных моделей для репродукции ви­ руса серьезно осложняет разрешение этой проблемы.

Рекомендуемая литература

Киселев Ф. Л., Павлиш О. Α., Татосян А. Г.

Молекулярные основы канцерогенеза у человека. — М.: Медицина, 1990.

Blumberg В. S. Hepatitis В virus, the vaccine,

Colombo M. Natural history and pathogenesis of hepatatis С virus related hepatocellular carcinoma. — 1999. — Vol. 31 (suppl. 1).

-P. 2 5 - 3 0 .

Harrison T. J. Viral hepatitis and primary liver cancer // Viruses and human cancer / eds. J. R. Arrand, D. R. Harper. — Oxford: Bios Scientific Publishers, 1998. — P. 17.

Hildt £., Hofschneider P. H., Urban S. The role of hepatitis В virus (HBV) in the de­ velopment of hepatocellular carcinoma // Seminars in Virology. — 1996. — Vol. 7.

-P. 333 - 347 .

5.5. ДНК-содержащие вирусы: герпеевирусы

В. Э. Гурцевич

Герпеевирусы — семейство Д Н К - содержащих вирусов, встречающихся в естественных условиях у человека и

животных. Герпесвирусы характеризу­ ются сходным устройством вириона и обладают следующими важными био­ логическими свойствами:

• кодируют большой спектр фер­ ментов, вовлеченных в метабо­ лизм нуклеиновых кислот, син­ тез Д Н К и процессинг белков;

•синтез вирусной Д Н К и сборка капсида у герпесвирусов проис­ ходит в ядрах инфицированных клеток;

•образование потомства у герпесвирусов обычно сопровождается разрушением инфицированных клеток;

•герпесвирусы могут оставаться в латентном состоянии и персистировать в течение всей жизни у их природных хозяев в опреде­ ленном типе клеток, которые могут быть различными для раз­ ных вирусов;

•латентные геномы герпесвиру­ сов обычно принимают форму циркулярно замкнутых эписом, при этом экспрессируется не­ большая часть вирусных генов.

Типичный вирион герпесвирусов

капсида, окруженного аморфной обо­ лочкой, и внешней липидной оболоч­ ки с вирусными гликопротеиновыми шипами на поверхности вириона. Диаметр герпесвирусных частиц варь­ ирует между 120 и 200 нм. Кроме ви­ русной Д Н К , вирусные частицы со­ держат 25—30 кодируемых вирусным геномом белков и фосфолипиды клет­ ки хозяина, происходящие из ядерной мембраны. Диаметр упакованной сердцевины зрелых вирионов, содер­ жащих 2-нитевую вирусную ДНК, со­ ставляет примерно 75 нм. Икосаэдральный капсид диаметром 100— 110 нм содержит 162 капсомера.

Герпесвирусная Д Н К может отли­ чаться по размеру, составу оснований и расположению уникальных и повто­ ряющихся последовательностей. Раз­ мер герпесвирусной Д Н К варьирует

от 120 до 230 т. п.н. и характерен для каждого рода.

Семейство герпесвирусов делят на 3 подсемейства — α, β и γ в зависимо­ сти от биологических свойств и ткане­ вого тропизма вирусов. Подразделе­ ние каждого подсемейства на роды базируется на гомологии последова­ тельностей Д Н К , сходства организа­ ции генома и антигенного родства ви­ русных белков. Так, подсемейство альфагерпесвирусов включает два рода —

Simplexvirus и Varicellovirus, известны­ ми представителями которых являют­ ся Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1), Her­ pes Simplex Virus-2 (HSV-2) и Varicellazoster Virus (VZV). Другое обозначение этих вирусов - HHV1, HHV2 и HHV3 соответственно. Представители а-гер- песвирусов имеют достаточно широ­ кий круг хозяев, а также относительно короткий продуктивный цикл в эпи­ телиальных клетках. Отличительной чертой данного подсемейства является их способность к установлению пер­ вичной латентной инфекции в сен­ сорном ганглии.

Подсемейство β-герпесвирусов со­ стоит из 2 родов — Cytomegalovirus и Muromegalovirus, прототипами кото­ рых являются соответственно цитомегаловирус человека (CMV или HHV5) и цитомегаловирус мышей (CMV мышей или MHV-1). HHV6 и HHV7 также отнесены к этому подсе­ мейству на основании их генетиче­ ской гомологии с CMV, хотя эти ви­ русы обладают некоторыми биологи­ ческими свойствами, характерными для γ-герпесвирусов. β-Герпесвирусы имеют ограниченный круг хозяев, и большинство видов (species) инфици­ рованы собственным CMV. Реплика­ ция β-герпесвирусов in vivo происхо­ дит в различных типах клеток, вклю­ чая эпителиальные. В латентном со­ стоянии вирусы могут находиться в лимфоретикулярных клетках, клетках секреторных желез, почек и других тканей. Инфекционный процесс на­ растает медленно и сопровождается увеличением размеров инфицирован­ ных клеток (цитомегалия) с появле-

тором для СЗс1-компонента компле­ мента CR2 (CD21). Идентичные или схожие молекулы были обнаружены и на Т-лимфоцитах, клетках фоллику­ лярного дендритического ретикулума и, возможно, некоторых эпителиаль­ ных клетках. Исследования показали, что клеточный тропизм EBV не огра­ ничен механизмом его взаимодейст­ вия с CD21, поскольку вирус был об­ наружен и в CD21-негативных клетках.

Заражение В-клеток EBV in vitro индуцирует их переход от стадии GO к стадии G1 клеточного цикла с после­ дующим синтезом Д Н К и клеточным делением. Активация вирусом клеточ­ ного цикла в значительной степени имитирует нормальный антигензависимый путь В-клеточной активации. Инфицированные клетки подвергают­ ся бласттрансформации с последую­ щим возникновением иммортализованных лимфобластоидных клеточных линий. Способность трансформиро­ вать В-клетки in vitro — характерное свойство EBV. В инфицированных клетках синтезируются многочислен­ ные белки, кодируемые вирусными и клеточными генами.

Начальные события при инфици­ ровании EBV В-клеток in vivo, вероят­ но, напоминают таковые in vitro при инфицировании покоящихся В-лим- фоцитов и заключаются в синтезе полного спектра вирусных латентных белков. При этом происходит быстрая поликлональная экспансия пула ин­ фицированных В-клеток, поскольку эффективный иммунный ответ еще не возник. Кроме того, пролиферация этих клеток in vivo стимулируется дву­ мя клеточными белками (Bcl-2, А-20), синтез которых усиливается под воз­ действием латентного мембранного белка LMP-1. Ранняя фаза индуциро­ ванной вирусом В-клеточной проли­ ферации тем не менее обрывается на­ растающим действием Т-клеточного иммунного ответа, что сопровождает­ ся уничтожением большей части ин­ фицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Несмотря на это, пул В-клеток, латентно инфици­

рованных EBV, и его репликация в клетках ротоглотки никогда полно­ стью не элиминируются.

5.5.2. Молекулярногенетическая организация

Геном EBV представляет собой двойную спираль Д Н К длиной около 172 т. п.н. Вирионная Д Н К вируса ли­ нейна. В латентно-инфицированных клетках Д Н К вируса существует в ос­ новном во внехромосомной эписомной ковалентно-замкнутой форме, ко­ торая образуется в результате циркуляризации вирусного генома по его терминальным повторам. При латент­ ном типе инфекции экспрессируется лишь небольшая популяция кодируе­ мых EBV белков, а вирусный геном в ядрах инфицированных клеток нахо­ дится в виде низкокопийных Д Н К - овых эписом. Эписомы EBV реплици­ руются на ранней стадии S-фазы кле­ точного цикла под воздействием кле­ точной ДНК-полимеразы, при этом число эписом может возрастать в те­ чение нескольких дней после инфи­ цирования клеток. Обнаружено также, что cis-действующая последователь­ ность, названная ori-P (точка инициа­ ции репликации), является важной для репликации и сегрегации эписом EBV. В некоторых случаях, в основ­ ном в определенных клеточных лини­ ях ЛБ, вирус включается в клеточный геном, хотя чаще всего остается во внехромосомной форме. В различных клеточных линиях вирусная Д Н К ин­ тегрирует в разные участки клеточно­ го генома. Биологическое значение интеграции вирусного генома остается неясным. Высказываются предполо­ жения, что эписомальная Д Н К необ­ ходима для литического цикла репли­ кации EBV, поскольку вирусную про­ дукцию ,не удавалось наблюдать в клетках, которые содержали только интегрированную Д Н К вируса.

Характерная черта генома EBV — наличие в нем большого числа повто­ ров, отличающихся в разных штаммах вируса и определяющих полиморфизм

Схема 5.10. Геном вируса Эпштейна—

Барр (Epstein—Вагг virus, EBV) и его экспрессия в латентно инфицированных клетках

ряда кодируемых белков по молеку­ лярной массе (схема 5.10). Большой внутренний повтор (IR1) разделяет ге­ ном ВЭБ на короткую (US) и длин­ ную (UL) уникальные области, кото­ рые находятся в одной и той же ори­ ентации относительно друг друга. В UL-области уникальные последова­ тельности U2 — U 5 чередуются с об­ ластями внутренних повторов IR2 — IR4, среди которых следует особо от­ метить гомологичные IR2 и IR4. Для идентификации и изучения индивиду­ альных генов вируса геном лаборатор­ ного штамма В95-8, являющегося прототипом EBV, разрезали с помо­ щью рестриктазы BamH I и получили соответствующие фрагменты рестрик­ ции, на которых базируется номенк­ латура открытых рамок считывания (ORFs) этого вируса (схема 5.11).

Представлены большие ДНК-повторы (1-IR4, TR), уникальные области (Ul—U5), а также транскрипты латентной инфекции EBV (EBNA, LMP, EBER, BARFO). EBNA мРНК транскрибируются с промоторных областей, расположенных в IR1 и U1 областях генома. Ori-P — точка начала репликации. Делеционные характеристики В95-8 и P3HR-1 штаммов EBV показаны затемненными блоками (B95DEL и P3DEL соответственно) (no Ro­ bertson Ε., Kieff Е., 1995)

5.5.3. Продукты вирусных генов

5.5.3.1. Экспрессия генов латентной инфекции

В многочисленных исследованиях показано, что в злокачественных клетках различных EBV-ассоцииро-

ванных опухолей, в том числе и эпи­ телиального происхождения, вирус находится в латентном состоянии. Это открытие сразу поставило ряд вопро­ сов: существует ли взаимосвязь между латентной инфекцией EBV и злокаче­ ственной трансформацией клеток хо­ зяина, какие — вирусные и/или кле­ точные — продукты контролируют статус инфекции, как осуществляется иммунный надзор и какие факторы приводят к реактивации инфекции. К настоящему времени обнаружено 11 генов латентной инфекции EBV: два из них кодируют малые неполиаденированные Р Н К (EBER-1 и EBER-2); шесть генов кодируют ядерные белки (ΕΒΝΑ-1, -2, -ЗА, -ЗВ, -ЗС и -LP) и три — мембранные белки вируса (LMP-1, LMP-2A и LMP-2B).

РНК, кодируемые EBV. Как уже было сказано, в латентно инфициро­ ванных клетках обнаружены по край­ ней мере две малые неполиаденированные Р Н К , кодируемые EBV (EBER-1 и EBER-2; EBERs). Количе­ ство этих Р Н К обычно достигает 107 копий на клетку. Они транскрибиру­

также принимать участие в их транс­ крипции. Большинство EBERs лока­ лизуется в ядре. Их биологическая

предположения. Согласно одному из них, роль EBERs заключается в сплайсинге первичных транскриптов м Р Н К EBNA и LMP. Эта и другие ги­ потезы, однако, находятся в противо­ речии с наблюдением, согласно кото­ рому экспрессия EBERs происходит уже после экспрессии EBNA и LMP генов, а также начала синтеза Д Н К . В опытах же по трансфекции было по­ казано, что рекомбинанты EBV, в ко­ торых EBERs были делетированы, осуществляют инфицирование В-кле- ток и их трансформацию точно так же, как и дикий тип вируса.

Кроме того, в клетках, латентно инфицированных EBV, происходит также синтез РНК, кодируемых дру­

гими открытыми рамками считыва­ ния, например BHRF1, ВатH1 А и BARF0. По-видимому, эти продукты не играют существенной роли в инду­ цированной вирусом трансформации и выполняют какие-то вспомогатель­ ные функции.

Ядерные белки EBV. Гены, коди­ рующие группу ядерных белков EBV (EBNAs), транскрибируются клеточ­ ной РНК-полимеразой II с образова­ нием единой м Р Н К длиной около 100 т. п.н. Эта транскрипционная единица начинается от двух вирусных промо­ торов, расположенных в областях ВатH1 С и ВатH1 W вирусного гено­ ма (Ср, Wp соответственно). Общий

EBNA-LP — белок, который коди­ руется геном, расположенным в об­ ластях BamH1 С, BamH1 W и BamH1 Υ вирусного генома. Размер EBNA-LP у разных вирусных изолятов варьирует благодаря изменяющемуся числу внутренних повторов (IR1), которые содержат W1 и W2 экзоны EBNA-LP. Этот белок фосфорилирован, вероят­ но, по сериновым остаткам, располо­ женным в экзоне W2 недалеко от мес­ та фосфорилирования казеинкиназы II. Транзиторная трансфекция EBNALP и EBNA-2 в первичные В-лимфо- циты, ко-стимулированные gp350, по­ казала, что оба белка, кооперируя ме­ жду собой, способствуют прохожде­ нию В-клетками GO и G1 фаз клеточ­ ного цикла, что подтверждалось ин­ дукцией циклина D-2. Механизм это­ го феномена остается пока не ясным. В целом же можно, по-видимому, предположить, что EBNA-LP необхо­ дим для трансформации В-лимфоци- тов, поскольку предполагается, что он вовлечен в регуляцию аутокринных факторов, необходимых для роста В- клеток. Показана ассоциация EBNALP in vivo и in vitro с белками теплово­ го шока.

EBNA-1 — единственный белок из группы ядерных белков EBV, который

По современной классификации все выделенные изоляты EBV могут быть отнесены к 1-му (А) или 2-му

(В) типу (EBV-1 и EBV-2 соответст­ венно) на основании их различий в областях BamH1 WYH и HindIII Ε ви­ русного генома. Изоляты EBV-1 обла­ дают более выраженной способностью трансформировать В-лимфоциты по сравнению с изолятами EBV-2. Кроме того, белки ΕΒΝΑ-2, кодируемые ви­ русными изолятами 1-го и 2-го типов, различаются по своим антигенным де­ терминантам, что позволяет различать их серологически. В мире первый тип вируса наиболее распространен, в то время как второй тип вируса больше распространен у лиц африканского происхождения.

Латентные мембранные белки. LMP-1 — латентный мембранный бе­ лок EBV (мол. масса 58—63 кДа), ко­ дируется геном с тремя различными рамками считывания в области ВатН1 N вирусного генома. Уровень его син­ теза в латентно инфицированных клетках выше уровня синтеза других

мембраны. Кроме того, белок состоит из 6 трансмембранных доменов, в пределах которых рассеяны короткие гидрофильные аминокислотные по­ следовательности. По крайней мере половина количества LMP-1 связана с цитоскелетом. Подобно ΕΒΝΑ-1, LMP-1 также транскрибируется во время литической инфекции. LMP-1 существенно изменяет рост EBV-нега- тивных В-лимфобластов и индуцирует множество изменений, которые обыч­ но ассоциируются с инфекцией EBV первичных В-клеток. Кроме того, LMP-1 усиливает продукцию опреде­ ленных цитокинов, таких, например, как IL-10, повышающих В-клеточную активность. В опытах по трансфекции единичного гена обнаружено, что LMP-1 обладает трансформирующими свойствами. Так, при трансфекции ге­ на LMP-1 в иммортализованные фибробласты грызунов наступала злокаче­

ственная трансформации клеток, под­ тверждаемая в опытах in vitro и in vivo. Рекомбинантные варианты EBV, в ко­ торых отсутствовал LMP - 1, не были способны трансформировать В-клетки.

Иммортализация клеток с помо­ щью EBV, как известно, зависит от постоянного контроля клетки за про­ цессами, регулирующими ее деление и апоптоз, и связана с функциями р53. При исследовании взаимоотно­ шений между латентными белками EBV и р53 обнаружено, что на 4—5-й день после инфицирования вирусом находящихся в покое очищенных В- клеток содержание в них р53 дикого типа увеличивается приблизительно в 10 раз. Вместе с тем в иммортализованных EBV В-клетках обнаружена экспрессия семейства белков, контро­ лирующих апоптоз, при этом рези­ стентность к апоптозу коррелировала с экспрессией Вс1-2 и А20, блокирую­ щих р53-индуцированную гибель кле­ ток. Экспрессия А20, как и р53, может регулироваться транскрипционным фактором NF-kB, активируемым, как известно, белком LMP -1 . Количест­ венные исследования показали, что во время протекания инфекции сущест­ вует прямая, хотя и временная, зави­ симость между уровнями белка LMP -

1и активностью NF-kB. Обнаружено также, что антиапоптотический эф­ фект EBV ассоциирован с высоким уровнем экспрессии Вс1-2 и EBV-за- висимым снижением устойчиво ста­ бильных уровней белка с-тус. За­ держки клеток в фазе G1 в результате нарушения регуляции экспрессии Bcl-

2при этом не происходит, т. е. LMP-1 не влияет на индукцию и функцию WAFl/p21, являющегося универсаль­ ным ингибитором циклинзависимых киназ. Приведенные выше и убеди­ тельные данные многих других иссле­ дований, свидетельствующие о транс­ формирующих потенциях LMP - 1, по­ зволили отнести этот ген к числу ви­ русных онкогенов.

LMP-2. Уникальная особенность генов LMP-2 (А и В) заключается в том, что транскрипционные единицы

EBV. Первый тип латентности (под­ разделяемый по уровню экспрессии еще на 3 группы), как правило, огра­ ничен экспрессией лишь EBER-1, -2 и EBNA-1. Экспрессия же других ге­ нов латентного цикла EBV существен­ но подавлена. Серийные пассажи та­ ких клеток in vitro сопровождаются расширением спектра экспрессии ви­ русных генов вплоть до появления фенотипических характеристик, свой­ ственных клеткам латентности типа III. При втором типе латентности спектр экспрессирующихся генов рас­ ширяется и к уже перечисленным вы­ ше генам в определенном проценте

ных вирусных генов, обнаруживаемая, например, в лимфобластоидных кле­ точных линиях (ЛКЛ) in vitro, а также клетках больных ИМ in vivo, расцени­ вается как латентность типа III.

5.5.5. Экспрессия вирусных генов

при EBV-ассоциированных заболеваниях человека

Спектр патологических процессов у человека, в возникновении которых, как полагают, участвует EBV, посто­ янно расширяется. Гены EBV экспрессированы при целом ряде как доброкачественных, так и злокачест­ венных лимфопролиферативных забо­ леваний, таких как инфекционный мононуклеоз, лимфома Беркитта, не­ которые гистологические варианты болезни Ходжкина (лимфогранулема­ тоза), определенные формы Т-клеточ- ных и В-клеточных лимфом и др. Кроме того, EBV ассоциирован и с за­ болеваниями, патогенез которых свя­ зан с малигнизацией эпителиальных клеток. К числу последних относят недифференцированный рак носо­ глотки, определенные гистологиче­ ские варианты рака желудка, слюнных и околоушных желез, а также ряд дру­ гих эпителиальных опухолей.

Лимфома Беркитта (ЛБ). Для Л Б

характерен тип I латентности с экс­ прессией только EBERs и EBNA-1. Лишь в редких опухолевых клетках наблюдают экспрессию других вирус­ ных генов (EBNA-2, LMP-1 и BZLF1), и еще реже клетки ЛБ могли входить в литический цикл.

Болезнь Ходжкина (БХ). При БХ (тип II латентности) показана экс­ прессия EBNA-1, поддерживающего вирус в эписомальном состоянии, LMP-1, индуцирующего экспрессию каскада маркеров, активирующих клетки, а также LMP-2A, блокирую­ щего индукцию литического цикла инфекции и усиливающего эффект трансформации.

Другие неходжкинские лимфомы.

Для относительно небольшой части лимфом характерен тип III латентно­ сти, в то время как для мономорфных опухолей экспрессия латентных бел­ ков EBV могла быть ограничена I или II типом. Кроме того, обнаружены опухоли, клетки которых экспрессировали EBNA-2 при отсутствии LMP-1, как это имеет место при ин­ фекционном мононуклеозе. Одна из форм СПИД-ассоциированных НХЛ, встречающаяся у больных с выражен­ ной иммуносупрессией, — диффузная крупноклеточная лимфома — являет­ ся, как правило, EBV-позитивной злокачественной опухолью и характе­ ризуется типом II или III латентности.

Рак носоглотки (РНГ). Анализ экс­ прессии латентных генов EBV пока­ зал, что для опухолевых клеток РНГ характерен тип II латентности. В част­ ности, обнаружена постоянная экс­ прессия генов BARFO, EBERs, LMP-1 и EBNA-1, в то время как EBNA-2, - ЗА, -ЗВ, -ЗС и -LP не экспрессируются. Экспрессия LMP-1 не всегда опре­ деляется во всех опухолевых клетках и исследуемых опухолях.

Рак желудка (РЖ). Анализ экс­ прессии латентных генов EBV в опу­ холевых клетках показал, что EBERs и EBNA-1 экспрессируются постоянно, но экспрессию EBNA-2 и LMP-1 об­ наружить не удается. Кроме того, по­ казана экспрессия LMP-2A и BZLF1.

KSHV позволил отнести его к подсе­ мейству гамма (γ) герпесвирусов, роду радиновирусов (Rhadinovirus), 8-му ти­ пу, на основании чего он был обозна­ чен как HHV-8 (Human Herpesvirus type 8). При этом было отмечено, что

троль за пролиферацией клеток. При­ водимые в настоящем обзоре данные, хотя и ограниченные, указывают на возможную этиологическую роль HHV-8 в возникновении СК и, воз­ можно, некоторых других неоплазий.

5.6.1 Морфология

имолекулярно-генетическая организация

HHV-8 по своим морфологическим характеристикам является типичным представителем подсемейства γ-гер- песвирусов с размером вирусных час­ тиц примерно 110 нм. Они имеют электронно-плотное ядро и окружены липидной оболочкой. Нуклеокапсиды с оптически плотным ядром обнару­ живаются в ядрах инфицированных лимфомных клеток, в то время как зрелые, содержащие оболочку вирионы размером 140 нм, — в их цито­ плазме. Подобные частицы наблюда­

ли и в биоптатах опухолей больных СК, где они локализовались в единич­ ных клетках веретенообразной морфо­ логии, представляющих собой опухо­ левые клетки эндотелиального проис­ хождения. Полагают, что, подобно другим герпесвирусам, HHV-8 в ла­ тентно инфицированных клетках реп­ лицируются в виде циркулярной кова- лентно-замкнутой эписомы и приоб­ ретают линейную геномную форму во время литического репликативного цикла. Размер и структура генома HHV-8 очень схожи с таковыми HVS: L U R размером 140,5 т. п.н., содержа­ щая все кодирующие области, флан­ кируется двумя TR варьирующей дли­ ны. Последние состоят из повторяю­ щихся функциональных единиц с вы­ соким соотношением G:C (84,5 %) и размером ~ 800 пар нуклеотидов. Об­ щая длина вирусного генома состав­ ляет примерно 165 кб (схема 5.12).

Линейный вирусный геном состо­ ит из длинной уникальной кодирую­ щей области (140,5 кб), фланкирован­ ной повторяющимися терминальными повторами (TR). Геном подразделяет­ ся на 7 блоковых областей (1—7), ко­ торые, как предполагают на основа­ нии гомологии с другими герпесвирусами, кодируют структурные белки и репликативные энзимы. Межблоко­ вые области генома (а—h) кодируют уникальные вирусные белки. Некото-

рые открытые рамки считывания в ге­ номе HHV-8 кодируют белки, гомоло­ гичные известным белкам человека: дигидрофолатредуктаза ( D H F R ) , тимидилатсинтаза (TS), вирусный ин - терлейкин-6 (vIL-б), вирусный макрофагальный воспалительный белок I и II типов (vMIP-I, vMIP-II), вирусный Bcl-2 (vBcl-2), вирусный циклин D (v- cyclin D) и вирусный гомолог рецеп­ тора интерлейкина-8 (GPCR) . Геном­ ные фрагменты, первоначально изо­ лированные Chang и Moore, находятся в области генов большого капсидного белка и оболочечного белка (Tegument protein). Указаны также вирусная ДНК-полимераза и вирусная тимидинкиназа (ТК).

TR представляет собой консерва­ тивную структуру герпес-вирусов, участвующую в упаковке вирусной

Д Н К в новые вирионы во время литического цикла репликации вируса. Эта область HHV-8 не содержит ни одной из O R F , имеющихся в соответствую­ щей области генома EBV. Гибридиза­ ция с TR, используемой в качестве пробы, является чувствительным тес­ том для детекции Д Н К HHV-8.

Все известные для HHV-8 ORFs, а их в настоящее время насчитывают не

для генов HVS, с которыми они име­ ют существенную степень гомологии. Для обозначения уникальных генов, не гомологичных генам HVS, исполь­ зуют букву К. Вполне вероятно, что в будущем у HHV-8 будут обнаружены дополнительные гены и альтернатив-

премированных генов, продукты ко­ торых важны для вхождения клетки в S-фазу. В противоположность ком­ плексу, сформированному из клеточ­ ного циклина типа D и cdk, комплекс, состоящий из v-cyclin D и cdk 6, не

подавляется ингибиторами cdk, таки­ ми как pl6lnk4a, p21Cipl и p27Kipl [8]. Ви­

русный гомолог клеточных циклинов является одним из немногих белков HHV-8, которые экспрессируются в веретеновидных клетках СК и латент­ но инфицированных клетках PELпроизводных клеточных линий. Исхо­ дя из вышеизложенного, следует, повидимому, заключить, что белок v-cy­ clin D может имитировать функцию мутантного белка ретинобластомы и приводить к подавлению ингибирования клеточного роста.

Гомологи ростовых факторов. Три гена HHV-8 обладают сходством сво­ их последовательностей с членами СС семейства ростовых факторов (хемокинов) человека. В частности, выявле­ ны два вирусных гомолога хемокинов, близких к белкам макрофагального воспаления MIP-I и MIP-11 (v-MIP-I и v-MIP-II), которые кодируются ORF Кб и ORF К4 соответственно. Белки, кодируемые ORF К6, по своему ами­ нокислотному составу примерно на 40 % идентичны белку MIP-II челове­ ка. Вопрос о том, играют ли v-MIP-I и v-MIP-II паракринную роль в воз­ никновении веретеновидных клеток СК либо их функция заключается лишь в усилении неоангиогенеза или модуляции инфильтрации макрофага­ ми и эозинофилами опухолевой тка­ ни, остается пока открытым.

Третий ген HHV-8 (ORF К2) из указанной группы кодирует вирусный гомолог интерлейкина-6 человека — v-IL-6. Оба белка на аминокислотном уровне имеют 25 % гомологию. v-IL-6 экспрессируется в латентно инфици­ рованных HHV-8 лимфомных и PELпроизводных клеточных линиях, но, как правило, не экспрессируется в опухолевых клетках СК. Эти данные, а также результаты эксперименталь­ ных исследований на бестимусных

мышах позволяют предположить, что v-IL-6 способствует пролиферации клеток гемопоэза, плазматических и эндотелиальных клеток. Подобно IL-6 человека, v-IL-6 через Jak-Stat-сиг- нальный путь активирует фосфорилирование STAT1, STAT3 и Jak 1, что ведет к индукции синтеза Д Н К , одна­ ко механизмы взаимодействия вирус­ ного и клеточного лигандов с клеточ­ ным рецептором IL-6 различаются. Экспрессия v-IL-6 в инфицированных HHV-8 В-клетках напоминает индук­ цию IL-6 человека в клетках, инфици­ рованных EBV. Вопрос о том, вносит ли свой вклад v-IL-6 в пролиферацию В-клеток, пока не решен.

Гены латентного цикла инфекции.

ORF 73 HHV-8 кодирует большой ядерный белок с мол. массой 224—236 кДа. Этот белок, обозначенный как LNA, является компонентом ядерного антигена, ассоциированного с латент­ ным состоянием HHV-8 (LANA) и об­ наруживается с помощью сывороток больных СК методами иммунофлюоресценции и иммуноблоттинга. LNA экспрессируется в латентно инфици­ рованных HHV-8 клетках PEL (и по­ лученных из них клеточных линиях), а также веретеновидных клетках СК. По аналогии с транс-активирующими белками других герпесвирусов, напри­ мер EBNA-1, EBNA-2 EBV, вполне логично предположить, что LNA ис­ ходно участвует в контроле за транс­ крипцией других вирусных генов, хо­ тя не исключается его воздействие и на экспрессию генов клетки-хозяина.

Вирусный интерферон-регулирую- щий фактор (v-IRF). ORF К9 кодирует вирусный гомолог IFR (v-IRF). Этот ген имеет небольшую, но достаточную гомологию с семейством белков IRF, ответственных за передачу сигнала интерферона. Два члена этого сиг­ нального пути, IRF-1 и IRF-2, явля­ ются антагонистами по отношению друг к другу в их эффекторных функ­ циях. IRF-1 позитивно регулирует сигналы интерферона, присоединяясь к специфическим энхансерным эле­ ментам (называемым интерферонсти-

мулирующими респонсивными эле­ ментами), расположенным в промоторных областях интерферониндуцибельных генов. Активированная транскрипция генов, стимулирован­ ная интерфероном, приводит к фенотипическим изменениям, характер­ ным для антивирусного состояния, индуцированного интерфероном. Это состояние включает индукцию белка р21 CDKI, который может привести к остановке клеточного цикла через ингибирование Rb и некоторые другие механизмы. IRF-2 обладает онкогенным действием на клетки N I H 3Т3, которое может быть отменено повы­ шенной экспрессией IRF - 1 . Подобно гомологам ростовых факторов, v-IRF экспрессируется в латентно инфици­ рованных клетках PEL, и экспрессия этого белка существенно усиливается после индукции литического цикла.

Вирусные белки, ингибирующие се­ мейство клеточных белков, содержа­ щих так называемый домен смерти. v-FLIP — вирусный белок, конверти­ рующий фермент 1В; является fas-ас­ социированным и содержит домен смерти, ингибирующий FLICE. Этот белок (кодируется O R F К13, также обозначаемой O R F 71) принадлежит к вновь открытому классу v-FLIP. v-FLIP вначале были идентифициро­ ваны у HHV-8 и других представите­ лей радиновирусов, так же как и ви­ руса контагиозного моллюска, на ос­ нове присутствия в них так называе­ мых эффекторных доменов смерти (DEDs). В последующем были также открыты клеточные гомологи этих белков [18]. v-FLIP обладает единст­ венным доменом D E D . Подобно кле­ точному гомологу, v-FLIP, кодируе­ мый HHV-8, может блокировать один из важнейших путей, с помо­ щью которого иммунный механизм приводит к гибели клеток, т. е. к ин­ дукции апоптоза с помощью семей­ ства рецепторов фактора некроза опухоли.

Вирусный гомолог рецептора, свя­ занного с G-белком. ORF 74 HHV-8 и HVS кодируют белок-гомолог рецепто-

ра, связывающий G-белок (v-GPCR), структура которого содержит 7 транс­ мембранных доменов. Этот рецептор обладает чрезвычайно высокой гомо­ логией на уровне аминокислотных по­ следовательностей к рецепторам рос­ тового фактора IL-8, ростового факто­ ра эндотелиальных клеток и ангиогенного фактора роста. Исследования транзиторной экспрессии v - GPCR по­ зволили предположить, что он конституитивно активен и не требует присоединения лиганда или активиру­ ется с помощью лиганда, обычно экспрессируемого клетками в культуральную среду. Трансфекция v - GPCR уси­ ливает пролиферацию фибробластов почек крыс, что говорит о его транс­ формирующих потенциях. Клеточ­ ный GPCR, который постоянно сти­ мулируется или становится конституитивно активным благодаря мута­ циям, может трансформировать клет­ ки и быть вовлеченным в патогенез некоторых новообразований челове­ ка. v - GPCR способен запускать сиг­ нальные каскады, ведущие к актива­ ции АР-1, являющегося транскрип­ ционным фактором, вовлеченным в процессы выживания клеток и их пролиферации, а также в активацию воспалительных и ангиогенных фак­ торов роста. Усиленная экспрессия v - GPCR в клеточных линиях PEL, обработанных ТРА, предполагает, од­ нако, что он экспрессируется в ос­ новном во время литической репли­ кации. В то время как его экспрессия в тканях СК была документирована с помощью RT-PCR, до сих пор не яс­ но, экспрессируется ли он в верете­ новидных клетках СК, латентно ин­ фицированных HHV-8, или в ограни­ ченном числе клеток в этих пораже­ ниях, подвергающихся литической репликации.

Другие вирусные гены. Первый ген на левом конце генома HHV-8 (ORF К1) кодирует трансмембранный гликопротеин, состоящий из 289 амино­ кислот. Его внеклеточный домен обо­ гащен цистеином и частично гомоло­ гичен легким цепям иммуноглобули-

на γ. ORF K1 проявляет выраженные трансформирующие свойства в экспе­ риментальных условиях in vitro и in vi­ vo. Дополнительные исследования, однако, показали, что ORF К1 в ла­ тентно инфицированных клетках кле­ точной линии BCBL не экспрессиру­ ется. Таким образом, роль O R F К1 в HHV-8-ассоциированном канцероге­ незе требует дальнейшего изучения, хотя его свойства, нарушающие регу­ ляцию роста клеток, позволили неко­ торым исследователям отнести его к онкогенам.

Известны и другие O R F HHV-8, гомологичные и негомологичные ге­ нам человека. Среди них гены, участ­ вующие в синтезе нуклеиновых ки­ слот, а также кодирующие различные белки. К числу последних относят бе­ лок-гомолог рецептора IL-8 (ORF 74), малый гидрофобный белок "капошин" (ORF К12) и ряд других белков с неиз­ вестной функцией. Изучение функ­ ций этих белков и их роли в транс­ формации клетки позволит, вероятно, в недалеком будущем пролить свет на молекулярную основу HHV-8-ассо- циированных патологий.

Сиквенсный анализ. При молеку- лярно-биологических исследованиях HHV-8 оказалось, что его изоляты

мом. Имеются тем не менее сообще­ ния о незначительных вариациях в последовательностях ORF 26 и неко­ торых областей ORF 75. Было также показано, что последовательности одного из генов (ORF К1), находяще­ гося на левом конце генома, могут

комплексном анализе нескольких ге­ номных областей общая вариабель­ ность нуклеотидного состава между изолятами достигала 1,5 %, что дало возможность разделить все известные вирусные изоляты на 4 основные группы, предварительно обозначен­ ные как А, В, С и D. Дальнейший си­ квенсный и филогенетический ана­ лиз вирусных изолятов различного

происхождения, возможно, поможет выяснить географическое происхож­ дение HHV-8 и пути его распростра­ нения на земном шаре.

5.6.3. Биологические свойства вируса. Клеточный тропизм

Персистенция в клетках СК. В на­ стоящее время последовательности HHV-8 могут быть обнаружены с по­ мощью таких методов исследования, как PCR в разных вариантах, PCR в сочетании с гибридизацией in situ или общепринятая гибридизация in situ. При помощи указанных тестов специ­ фические последовательности HHV-8 были обнаружены в эндотелиальных и веретенообразных клетках опухоле­ вой ткани больных СК, циркулирую­ щих эндотелиальных клетках этих же больных, лимфомных клетках боль­ ных PEL, макрофагах, дендритных клетках и железистом эпителии пред­ стательной железы у инфицированных вирусом лиц. В опытах с использова­ нием PCR в реакции гибридизации in situ было показано, что HHV-8 можно часто обнаружить как в атипических, так и опухолевых (веретенообразных), но не в нормальных эндотелиальных клетках здоровых тканей больных СК. Эти данные были подтверждены в опытах с использованием микродиссекции, а также методами гибридиза­ ции in situ и иммуногистохимии с LANA. Исследования показали, что в большинстве веретенообразных кле­ ток СК имеет место персистирующая инфекция HHV-8, о чем свидетельст­ вует экспрессия генов, кодируемых в

ORF К12, ORF 72 и ORF 73. Как уже было сказано выше, ORF 72, коди­ рующий гомолог циклинов типа D млекопитающих, проявляет свою функциональную активность, фосфорилируя ретинобластомный белок pRb, являющийся опухолевым супрессором. ORF 73 кодирует LANA, функ­ ция которого пока не известна, как и функция небольшого гидрофобного белка, состоящего из 60 аминокислот

и кодируемого ORF К12. Вирусный гомолог IL-6, кодируемый ORF К2, синтезируется в латентно инфициро­ ванных клетках PEL, но обычно не выявляется в опухолевых клетках больных СК. В атипических клетках плоскоклеточного эндотелия, обнару­ живаемых на ранних стадиях СК (пят­ на), выявляют только РНК-транс­ крипт Т0.7 ORF 12, соответствующий латентному циклу инфекции. Таким образом, в настоящее время имеется ряд независимых доказательств, сви­ детельствующих о том, что HHV-8 ин­ фицирует опухолевые клетки больных СК и персистирует в них. В то же вре­ мя практически все первичные кле­ точные линии, полученные из клеток биоптатов опухолей этих же больных, в процессе культивирования теряли вирусный геном и лишь очень немно­ гие сохранили HHV-8 на протяжении серии пассажей.

Персистенция в гематологических клетках. Большинство активно экспрессируемых транскриптов HHV-8 в клеточных линиях, полученных из PEL, представляют собой полиаденилированные транскрипты, кодируе­ мые ORF К12 (ТО.7) и ядерной нетранслируемой Р Н К (Т1.1). В этих же клеточных линиях экспрессируются (хотя на очень низких уровнях) и бел­

и др. В-клетки и макрофаги также мо­ гут содержать генетическую информа­ цию этого вируса. Обнаружение в крови и очагах поражения больных СК клеток с маркерами эндотелиаль­ ных макрофагов, инфицированных HHV-8, помогает объяснить вирусную нагрузку, ассоциированную с возник­ новением СК. Эти данные позволяют также предположить, что инфициро­ ванные моноциты могут привносить вирус в ткань, переносить инфекцию или дифференцироваться локально в веретенообразные клетки, несущие маркеры эндотелиальных макрофагов.

Персистенция в клетках простаты.

Другим местом возможной локализа­ ции вируса является простата. У неко­ торых мужчин из эндемичных для HHV-8 регионов вирусные маркеры обнаруживали в семенной жидкости. Нельзя исключить, что источником HHV-8 в семени являются мононуклеарные клетки крови, инфицирован­ ные вирусом. В то же время у больных СПИД-ассоциированной формой СК геном HHV-8 с постоянством обнару­ живали в тканях простаты. Выполнен­ ные с помощью метода гибридизации in situ исследования показали, что в железистом эпителии простаты лиц даже без СК могут быть экспрессированы некоторые гены латентной ин­ фекции HHV-8. Эти находки позволя­ ют предположить, что данный вирус довольно широко распространен сре­ ди мужчин, по крайней мере в геогра­ фических регионах, эндемичных для этого вируса. Вне эндемичных регио­ нов анализ простатической ткани с помощью PCR у лиц без СК вирусных последовательностей не обнаружил.

HHV-8 также находили в мокроте, слюне, смывах из ротоглотки, про­ мывных бронхоальвеолярных водах, но эти находки были сделаны глав­ ным образом у больных СК.

5.6.4. Эпидемиология HHV-8

5.6.4.1. Данные PCR-анализа

Распространение HHV-8 среди на­ селения различных географических регионов и отдельных групп риска оценивается главным образом по дан­ ным PCR и серологических исследо­ ваний. Поскольку используемые мето­ ды различаются по своей чувствитель­ ности и специфичности, то получае­ мые результаты неоднозначны и могут варьировать.

При изучении РВМС здоровых лиц из стран с низкой заболеваемостью СК, таких как США, Франция или Англия, специфические последова­ тельности HHV-8 не были выявлены даже методом "гнездной" PCR. В стра-

СК, хотя это наблюдение нуждается в дальнейшем подтверждении. Но самый высокий процент серопозитивных лиц к различным антигенам HHV-8 был обнаружен в странах Восточной, Цен­ тральной и Западной Африки. При этом в регионах, эндемичных для СК, уровень инфицированности среди на­ селения достигал 50—70 %.

Таким образом, данные серологи­ ческих исследований позволяют сде­ лать вывод о том, что HHV-8 не явля­ ется убиквитарной инфекцией для на­ селения западноевропейских стран и США, но приближается к таковой для населения некоторых регионов Аф­ рики.

5.6.4.3. Пути передачи инфекции

Основной путь передачи HHV-8 в странах с низким уровнем инфициро­ ванности населения — половой путь. Высказанное предположение подтвер­ ждается и данными PCR, согласно ко­ торым вирус у инфицированных лиц часто обнаруживается в клетках семе­ ни, а также, хотя и крайне редко, в цервико-вагинальном секрете. Остает­ ся все же неясным вопрос, какую роль играет половой путь передачи вируса, поскольку СК по наблюдениям в раз­ личных странах у мужчин встречается в 2—5 раз чаще, чем у женщин. Обна­ ружение вирусспецифических антител и вирусных последовательностей в клетках крови детей, не достигших половозрелого возраста, из эндемич­ ных по СК стран, например Замбии, где общая инфицированность среди лиц 14—84 лет достигает 58 %, так же как нарастание процента инфициро­ ванных детей с увеличением их воз­ раста, указывает на возможность и не­

дача вируса со слюной. Действитель­ но, вирус, изолированный из образ­ цов слюны инфицированных лиц, проявлял свои инфекционные свойст­ ва в культуре ткани, что свидетельст­ вует о его биологической активности.

21*

5.6.5. Заболевания человека, связанные с HHV-8

5.6.5.1. Саркома Капоши

Саркома Капоши (СК) представля­ ет собой многофокусный неопластиче­ ский процесс, возникший из эндоте­ лия кровеносных и лимфатических со­ судов, главным образом дермы. В соот­ ветствии с международной классифи­ кацией ВОЗ СК — это злокачественная опухоль кровеносных сосудов.

В настоящее время различают не­ сколько форм СК: спорадическую (так называемую классическую, или идиопатическую), эндемическую (аф­ риканскую), эпидемическую (СПИД - ассоциированную) и связанную с иммунодефицитными состояниями (обычно у реципиентов органных и тканевых трансплантатов). Гистологи­ ческая картина при всех указанных формах болезни существенно не раз­ личается и характеризуется периваскулярными инфильтратами в сетча­ том слое дермы, состоящими из ок­ руглых клеток с крупными ядрами: лимфоцитов, гистиоцитов, реже плазмоцитов. В инфильтратах формируют­ ся сосуды, представляющие собой скопления концентрически располо­ женных веретенообразных опухолевых клеток.

Результаты многочисленных иссле­ дований, проведенных в последние годы, свидетельствуют о том, что наи­ более вероятным фактором, вызываю­ щим СК, является HHV-8. Основани­ ем для такого утверждения являются следующие положения:

•данные PCR-анализа сотен об­ разцов опухолевой ткани боль­ ных СК, согласно которым при­ мерно в 90 % случаев удается вы­ явить вирусспецифические по­ следовательности, при этом ви­ русные Р Н К и Д Н К можно об­ наружить в большинстве опухо­ левых клеток;

•моноклональность вируссодержащих опухолевых клеток сар-

323

коматозных узлов больных СК, что свидетельствует о его проис­ хождении из одной единствен­ ной клетки, исходно инфициро­ ванной HHV-8;

холевых клетках СК . Клетки PEL, од­ нако, в отличие от клеток СК очень активно экспрессируют v-IL-6.

Другое лимфопролиферативное за­ болевание, с которым ассоциация

следований: более высокий про­ цент серопозитивных лиц в оп­ ределенных географических ре­ гионах и группах риска, как пра­ вило, совпадает с повышенной заболеваемостью среди них СК.

К группам риска относятся ВИЧинфицированные лица, больные СΠ ИДом, мужчины-гомосексуалисты, больные иммунодефицитными со­ стояниями различного генеза и т. д. Было также показано, что по крайней мере у больных С П И Д о м инфициро­ вание HHV-8 предшествует появле­ нию СК.

5.6.5.2. Лимфопролиферативные заболевания

Кроме СК, заболеванием, тесно ассоциированным с HHV-8, является BCBL, обычно выявляемая у ВИЧинфицированных больных с тяжелы­ ми иммунодефицитными состояния­ ми. При этом довольно редком забо­ левании опухолевые массы и пора­ женные опухолевым процессом лим­ фатические узлы отсутствуют, в то время как лимфомные клетки в виде выпота обнаруживают в плевральной, перикардиальной или перитонеальной полостях. Такая особенность клини­ ческого проявления болезни позволи­ ла некоторым исследователям назвать это патологическое состояние первич­ но выпотной лимфомой (PEL). Клет­ ки выпота состоят из зрелых В-клеток нулевого фенотипа, хотя описаны слу­ чаи PEL с клетками, содержащими на своей поверхности В- и/или Т-кле- точные маркеры. Как показали иссле­ дования, характер и спектр экспрес­ сии вирусных генов в клетках PEL (анализируемые главным образом на стабильных клеточных линиях) прак­ тически совпадают с таковыми в опу­

M C D . Болезнь характеризуется поликлональной лимфопролиферацией с выраженной васкуляризацией лимфо - идной ткани. Образцы биопсийного материала от ВИЧ-инфицированных больных M C D в большинстве случаев содержали вирусные последовательно­ сти HHV-8. Наоборот, у ВИЧ-нега­ тивных больных присутствие вируса обнаруживали не так часто (до 40 % ) . Таким образом, несмотря на клиниче­ ское сходство между M C D и СК, осо­ бенно проявляющееся у больных СПИДом, ассоциация HHV-8 с M C D (в отличие от СК и PEL) не является универсальной.

* * *

Подводя итог нашим знаниям о HHV-8, следует сказать, что его роль в патогенезе СК, PEL и M C D до сих пор окончательно не выяснена. Из­ вестно, что вирус постоянно присут­ ствует в опухолевых клетках СК и PEL, причем эти клетки моноклональны по своему происхождению. Известно также, что в клетках этих опухолей экспрессируется вирусный гомолог клеточных циклинов типа D, который может привести к наруше­ нию контроля за клеточным циклом и, таким образом, играть важную роль в генезе патологических состояний, ассоциированных с HHV-8. В то же время до сих пор не ясно, нужна ли HHV-8 для осуществления клеточной трансформации программа латентной экспрессии генов, обнаруженная у EBV. Если нужна, то как это сочетает­ ся с литическим циклом инфекции HHV-8, имеющим место в веретено­ образных клетках СК? Ответ на этот

экспрессия усиливается во время ли­ тической инфекции (например, v-IL- 6), могут способствовать опосредован­ ной вирусом экспансии веретенооб­ разных клеток. Существует также оп­ ределенная гомология между генами HHV-8 и клеточными генами, участ­ вующими в контроле роста и проли­ ферации клеток. Сказанное в равной степени относится к патогенезу СК и PEL. Таким образом, кодируя целый набор белков, гомологичных клеточ­ ным белкам, вовлеченным в цикл кле­ точной прогрессии и передачи сигна­ лов, HHV-8 является неоспоримым кандидатом в онкогенные вирусы че­ ловека.

Дальнейшие исследования, по-ви­ димому, будут сфокусированы на изу­ чении онкогенного потенциала виру­ са, идентификации кодируемых виру­ сом белков, принимающих участие в трансформации клеток, анализе взаи­ моотношений вируса с иммунной системой хозяина, выявлении кофак­ торов, необходимых для реализации его онкогенных потенций, поиске удобных и чувствительных моделей in vitro и in vivo и т. д. Но уже сегодня можно с уверенностью сказать, что HHV-8 представляет собой уникаль­ ный и весьма перспективный объект для изучения, который в руках иссле­ дователей откроет новые, еще не из­ вестные стороны сложных процессов взаимоотношений между вирусом и клеткой, приводящих к возникнове­ нию опухоли.

Рекомендуемая литература

Казанцева И. А. Саркома Капоши: этиоло­ гия, патогенез, гистогенез, патоморфологическая диагностика // Российск. журн. кожн. и венер. бол. — 1998. — Т. 1. - С. 6 - 9 .

Chang Y, Gesarman Ε., Pessin Μ. S. et al.

Identification of herpesvirus-like DNA se­ quences in AIDS-associated Kaposi's sar­ coma // Science. — 1994. — Vol. 206. — P. 1865-1869.

Epstein—Barr virus and Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 // Monogr. Eval. Carcinog. Risks. Hum . — Lyon:

Schulz T. F. Kaposi's sarcoma-associated her­ pesvirus (human herpesvirus-8) // J. Gen. Virology. - 1998. - Vol. 79. — P. 1573.

5.7. Ретровирусы: вирус Т-клеточного лейкоза человека

В. Э. Гурцевич

Ретровирусы — группа РНК-содер- жащих вирусов, способных на геном­ ной РНК, как на матрице, с помощью фермента обратной транскриптазы соз­ давать комплементарную копию Д Н К и инкорпорироваться в геном клеткихозяина. Все ретровирусы образуют се­ мейство (Retroviridae), в котором на ос­ новании комплекса критериев, таких как ассоциация с болезнью, морфоло­ гия вирусных частиц и способность вызывать цитопатогенный эффект in vitro, были выделены три подсемейства. Среди них различают подсемейства он­ ковирусов, лентивирусов и спумавирусов. Онковирусы в свою очередь состо­ ят из четырех морфологических субти­ пов — ретровирусов типа А, В, С и D. Согласно сообщению Международного комитета по таксономии вирусов, все ретровирусы подразделяются на 7 ро­ дов:

•род ретровирусов млекопитаю­ щих типа В;

•род ретровирусов млекопитаю­ щих типа С;

•род ретровирусов птиц типа С;

•род ретровирусов типа D;

•род ретровирусов HTLV-BLV;

•род лентивирусов;

•род спумавирусов.

Существует еще одна классифика­ ция онкогенных ретровирусов по био-

логическим свойствам и структуре ге­ нома, согласно которой выделяют 3 основных типа онковирусов: саркомные, вирусы острой лейкемии и лим- фоидно-лейкозные вирусы.

Ретровирусы подразделяют еще на простые и сложные, исходя из орга­ низации их генома. К сложным отно­ сят ретровирусы, которые, кроме структурных генов gag, pol и env, со­ держат гены, регулирующие экспрес­ сию структурных генов. Большая часть онковирусов, лентивирусов и спумавирусов, полученных от челове­ кообразных и нечеловекообразных приматов, относится к сложным ретровирусам (см. также табл. 5.2 в раз­ деле 5.1).

Вирионы ретровирусов, диаметр которых составляет 80—100 нм, имеют сферическую форму и покрыты гликопротеиновой оболочкой. В располо­ женной внутри вириона сферической или икосаэдральной формы сердцеви­ не упакован вирусный нуклеокапсид. В вирусных частицах типа В нуклео­ капсид расположен эксцентрично, в вирионах типа С, HTLV-BLV и спу­ мавирусов — по центру, а в вирионах лентивирусов имеет форму палочки или усеченного конуса.

Плавучая плотность вирионов рет­ ровирусов составляет 1,16—1,18 г/см3 в градиенте сахарозы. Они чувствитель­ ны к нагреванию, детергентам и фор­ мальдегидам. Различают 2 белка вирус­ ной оболочки (поверхностный — SU и трансмембранный — ТМ), кодируемых вирусным геном env, и 3—6 внутрен­ них негликозилированных структурных белков, кодируемых геном gag. В ви­ рионах описаны также белки матрикса (МА), капсида (СА) и нуклеокапсида (NC). Среди других белков выделяют протеазу (ПР), кодируемую геном pro, обратную транскриптазу (RT) и интегразу (IN), кодируемые геном pol.

Многочисленными исследования­ ми показано, что онкорнавирусы типа С являются возбудителями лейкозов и сарком у рептилий, птиц, мышей, крыс, кошек, крупного рогатого ско­ та, обезьян и человека. Онковирусы

В-типа — это возбудители опухолей молочной железы мышей и, возмож­ но, обезьян и человека. Роль ретрови­ русов типа D в патологии человека пока не ясна, однако известно, что вирус вызывает иммунодефицитные состояния обезьян и, вероятно, ассо­ циируется с развитием аденокарцином легких. Настоящий и следующие разделы будут посвящены некоторым членам этой разнообразной группы ретровирусов, онкогенный потенциал которых интенсивно изучается.

5.7.1. Вирус Т-клеточного лейкоза человека

HTLV относится к сферическим, оболочечным ретровирусам диаметром 80—100 нм. Вирион HTLV состоит из внешней двухслойной липидной обо­ лочки и нуклеокапсида. Последний со­ держит различные типы белков, а так­

BLV, HTLV-I, HTLV-II и STLV.

HTLV-I и HTLV-II, открытые в 1980 и 1981 гг. соответственно, очень близки по структуре своего генома и серотипу, хотя имеют и некоторые различия. Среди указанных двух пред­

HTLV-I (LTR и области гена env) с их последующим филогенетическим ана­ лизом позволило идентифицировать 4

Ib), меланезийский (HTLV-I с) и но­ вый субтип HTLV-Id, недавно обнару­ женный у пигмеев Центрально-Афри­ канской Республики. На основе ана­ лиза LTR в составе космополитиче­ ского субтипа выделены еще 5 групп вирусов: трансконтинентальная груп-

па (А), включающая вирусные изоля­ ты практически из любого географи­ ческого региона планеты (Южная Аф­ рика, Япония, Северная и Южная Америка, Индия, Иран, Россия и т. д.), Японская группа (В), западноафриканская/карибская группа (С), североафриканская группа (D) и не­ давно выделенная от негров Перу группа (Е). В отличие от изолятов группы А изоляты, входящие в группы В, С, D и Е, обнаружены в строго оп­ ределенных географических регионах. Что касается HTLV-II, то этот вирус­ ный тип филогенетически подразде­ ляется на 3 молекулярных субтипа: HTLV-IIa, HTLV-IIb и HTLV-IIc. Ин­ тересно отметить, что около 70 % нар­ команов в Европе и Северной Амери­ ке, применяющих наркотики внутри­ венно, инфицированных этим типом вируса, содержат субтип HTLV-IIa. Племена американских индейцев Центральной и Северной Америки инфицированы различными варианта­ ми HTLV-IIb, в то время как среди

изолированных от внешнего мира племен на Амазонке персистирует главным образом HTLV-IIa.

Поскольку биологические свойства и молекулярная структура генома у HTLV и STLV очень сходны, оба типа вирусов помещены в одну объединяю­ щую их группу — группу Т-лимфо- тропных вирусов приматов (PTLV).

Учитывая генетическое родство между двумя представителями HTLV, HTLV-I и HTLV-II, с одной стороны, а также выраженную биологическую активность вируса первого типа (в от­ личие от вируса второго типа) — с другой, дальнейшее описание свойств этой группы вирусов будет проводить­ ся на примере HTLV-I.

5.7.1.1. Структура генома HTLV-I и основные кодируемые белки

Структура генома HTLV-I сходна с другими ретровирусами, но обладает существенным отличием (схема 5.14).