6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть VI. Механизмы старения: демографические и теоретические аспекты

Ò à á ë è ö à 19.2

Продолжительность жизни и частота спонтанных опухолей у мышей различных линий (Smith et al., 1973; Anisimov, 1987)

жизни животных, но может не оказывать никакого влияния на нормальное старение и долголетие у мышей.

Гибридные популяции мышей более устойчивы к возрастной патологии, чем чистые линии, и первые генерации (F1), полученные при скрещивании инбредных мышей, также генетически однородны, что позволяет минимизировать число мышей в группах. В табл. 19.3 приведены сведения о средней продолжительности жизни инбредных линий и гибридных популяций мышей и крыс, наиболее часто используемых в исследованиях Национального института старения США.

В некоторых исследованиях используются аутбедные (беспородные) мыши, которые более генетически гетерогенны, что, безусловно, положительно. Однако при использовании таких мышей нужно их большое коли-

Ò à á ë è ö à 19.3

Средняя продолжительность жизни некоторых линий грызунов, в месяцах (Turturro et al., 1999)

321

В. Н. Анисимов

чество в группах, так как в противном случае некоторые аллели могут быть утеряны и генетическая характеристика со временем может измениться. Следует отметить, однако, что популяции аутбредных животных поддерживаются стадной разводкой, т. е. они достаточно генетически близки.

Одной из возможных моделей, несколько уменьшающей недостатки как инбредных, так и аутбредных линий мышей, являются генетически гетерогенные животные, второе поколение (F2) которых является потомством четырех, а F3 — потомством восьми родительских линий (Nadon, 2006).

Мы полагаем, что многолетний опыт использования в лаборатории, проводящей такие испытания, той или иной линии мышей может стать определяющим при выборе линии мышей или крыс для тестирования геропротекторов. При возможности мы используем в своих исследованиях все три типа мышей — инбредных, аутбредных и генетически модифицированных. Например, геропротекторный эффект мелатонина нами был изучен на инбредных СВА, аутбредных SHR, трансгенных HER/2-neu, мутантных SAMP-1 и контрольных к ним SAMR-1 мышах, крысах, а также нематодах

èплодовых мушках (см. главу 12).

Âпоследние годы в экспериментальной геронтологии при тестировании геропротекторов стали широко использоваться генетически модифицированные (трансгенные, нокаутные, мутантные) мыши с измененной продолжительностью жизни. Аргументом против их использования с такой целью может быть малое соответствие нормальному старению человека. Однако они могут быть незаменимыми при исследовании тех или иных специфиче- ских механизмов старения.

Âряде работ обсуждается роль таких важных для корректного проведения экспериментов факторов, как условия содержания и диета (Melby, Altman, 1974; Ward, 1983; Anisimov, 1987; Turturro et al., 1999; Nadon, 2006).

19.3.ПРОГРАММЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕРОПРОТЕКТОРОВ

Â2000 г. нами была обосновано предложение о создании международной программы оценки эффективности и безопасности применения геропротекторов (Anisimov, 2000). Ее деятельность могла бы осуществляться под наблюдением Программы старения ООН и Международной ассоциации геронтологии, успешное сотрудничество которых обеспечило разработку Программы по исследованиям старения в XXI веке. За основу можно было бы взять хорошо зарекомендовавшие себя программу оценки канцерогенного риска для человека химических веществ и программу оценки средств профилактики рака, осуществляемые Международным агентством по изу- чению рака, публикующего соответствующие серии монографий и руководств (Montesano et al., 1986; Vainio et al., 1992).

322

Часть VI. Механизмы старения: демографические и теоретические аспекты

Задачей программы является подготовка международной рабочей группой экспертов критического обзора, системы и методологии оценки доказательств геропротекторной активности и эффективности препарата или иного средства. Эксперты также могут давать рекомендации о необходимости дополнительных исследований.

Публикации результатов работы рабочей группы экспертов будут содействовать национальным и международным учреждениям здравоохранения в планировании и реализации программ оздоровления и профилактики преждевременного старения и принятии решений о соотношении поль- за—риск таких программ. Рабочие группы экспертов будут давать только научное заключение об имеющихся доказательствах геропротекторной эффективности и безопасности препаратов и средств, и не призваны давать рекомендации национальным или международным по регулированию или законодательству применения тех или иных препаратов или средств, что является исключительной прерогативой этих учреждений или организаций.

Критерии, которые могут быть использованы для оценки, должны быть определены как степени доказанности эффективности тех или иных рекомендаций по применению геропротекторов. Таких степеней может быть четыре.

1.Имеются достаточные доказательства эффективности средства, подтвержденные в эпидемиологических многоцентровых рандомизированных исследованиях.

2.Эффективность средства подтверждена многочисленными экспериментальными исследованиями на животных разных видов, тогда как достаточные доказательства эффективности в эпидемиологических многоцентровых рандомизированных исследованиях отсутствуют или получены только

âотдельных наблюдениях.

3.Об эффективности средств имеются единичные сообщения, степень надежности которых достаточно высока.

4.Имеются единичные неподтвержденные сообщения об эффективности средства.

Следует признать, что в настоящее время нет ни одного препарата, который можно было бы отнести к группе 1, т. е. геропротекторная активность которого была бы безусловно доказана на людях. К средствам, которые можно было бы включить в группу 2, по-видимому, следует отнести мелатонин, дегидроэпиандростерон, эпиталамин, тималин, антидиабетиче- ские бигуаниды, некоторые антиоксиданты. Имеются многочисленные подтверждения геропротекторного эффекта этих препаратов, полученные в экспериментах на животных, а также ряд публикаций об эффективности их применения в клинической практике (см. главу 12). По-видимому, эти препараты являются наиболее вероятными кандидатами для проведения многоцентровых рандомизированных клинических испытаний.

В 2003 г. Национальным институтом старения США была начата Программа тестирования средств воздействия на старение (Interventions Testing Program, ITP), предполагающая использование мышей для тестирования веществ с геропротекторной активностью и улучшающих здоровье в старче-

323

В. Н. Анисимов

ском возрасте (Warner et al., 2000; Nadon, 2006). Определен и пополняется список веществ, эффективность которых предполагается оценить (см. вебсайт: www.nia.nih.gov/research/InterventionsTestingProgram.asp). По этой программе уже были изучены аспирин, нордигидрогуаретиновая кислота, нитрофлюородипрофен и 4-OHPBN (Nadon, 2006).

Протокол испытаний по программе ITP включает 2 фазы. В течение первой фазы изучается способность вещества увеличивать продолжительность жизни. При этом дополнительно оценивается небольшое число параметров, таких как активность животных в молодом и старческом возрасте, уровень метаболических гормонов и субпопуляции Т-лимфоцитов. Во второй фазе испытаний препараты, показавшие обнадеживающие результаты, подвергаются более интенсивному исследованию с целью выявления таких, которые могут быть испытаны в дальнейшем на людях. В этой фазе производится исследование поведенческих реакций (когнитивные и поведенче- ские тесты), измерение окислительного стресса, патоморфологическое исследование павших животных. Все условия содержания, диета и протокол тестирования были унифицированы и стандартизированы.

Весьма перспективным при оценке эффективности геропротекторов может оказаться исследование современных биомаркеров, основанное на микрочиповой технологии, т. е. изучение экспрессии генов, имеющих отношение к продолжительности жизни и долголетию (Warner, 2004; Anisimov S. V., 2007; Spindler, Mote, 2007).

19.4. МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА СТАРЕНИЕ

ÈПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ МЫШЕЙ

Âнашей лаборатории был разработан и в течение многих лет успешно используется стандартный протокол испытаний потенциальных геропротекторов, который включен в изданное в 2007 г. в США руководство «Биология старения: Методы и протоколы» (Anisimov et al., 2007).

Животные. Выбор линии. Рекомендуется использовать две или более линий мышей одновременно, комбинируя аутбредные и инбредные линии. Дополнительно могут быть использованы генетически модифицированные животные. Линии мышей должны быть хорошо охарактеризованы генети- чески, должны быть известны их продолжительность жизни и спонтанная патология. Наиболее важным аспектом является длительный опыт работы с используемыми линиями в лаборатории, где такое исследование будет выполняться. Желательно использовать оба пола мышей. При ограниченных возможностях предпочтение отдается самкам, поскольку самцы при групповом содержании агрессивны и убивают более слабых особей.

Условия содержания. Животные должны содержаться при стандартной температуре и влажности. Требования к виварию и общие требования ухода

324

Часть VI. Механизмы старения: демографические и теоретические аспекты

подробно описаны в литературе (Poiley, 1974; Van Zutphen et al., 2001). Самок мышей содержат в одинаковом количестве на клетку (по 5, 7 или 10 голов) в контрольной и подопытных группах. Самцы из-за агрессивности содержатся по одному в клетке. Стандартный размер клетки для группового содержания мышей 30 21 14 см. В комнате должен поддерживаться стандартный режим освещения: 12 ч свет : 12 ч темнота. Животные должны получать фильтрованную водопроводную воду и стандартный брикетированный корм без ограничения (если не предусматриваются специальные условия кормления или диета).

Возраст в начале воздействия. При долговременных экспериментах введения препаратов в подопытных группах следует начинать в возрасте 2 месяцев, вскоре после полового созревания (у самок оценивается по открытию влагалища). В специальных случаях можно начинать введения в

более позднем возрасте.

Рандомизация животных. Перед началом введения препаратов (за 1—2 недели) животные случайным образом разделяются на контрольную и подопытные группы. Количество животных должно быть достаточным для дальнейшей статистической обработки результатов (обычно 30—50 голов в каждой группе).

Способ введения препарата, доза и режим введения. Оптимальным является введение препарата с питьевой водой или добавление его в корм. При плохой растворимости вещества в воде допустимо его предварительное растворение в небольшом количестве этанола с последующим разведением в воде до нужной концентрации. Для более точной дозировки можно использовать введение водных растворов или суспензий препаратов в 1 % растворе крахмала через желудочный зонд 3—5 раз в неделю.

При необходимости парентерального введения испытуемого препарата его растворы в соответствующей концентрации вводятся 1 раз в неделю подкожно в объеме 0.1 мл. Внутрибрюшинное введение является более стрессирующим и увеличивает риск инфицирования.

Рекомендуется введение испытуемого вещества в 2—3 дозах, включая дозу, в которой предполагается его введение человеку. Максимальная доза не должна превышать максимально переносимую дозу (MTD). Рекомендуется постоянное введение препарата до естественной гибели животных, однако допустимо курсовое введение препаратов, особенно гормонов. В таких случаях препарат вводят 5 дней подряд, а затем делают 3-недельный перерыв во введениях (Rhomberg et al., 2007).

Наблюдение за животными. В течение всего эксперимента должно быть обеспечено ежедневное наблюдение за животными, регулярная регистрация количества выпитой жидкости и потребленного корма (ежемесяч- но), измерение температуры тела, физической силы и активности, исследование эстральной функции (у самок). За животными наблюдают до их естественной смерти. Допустимо умерщвление животных, находящихся в состоянии крайней слабости. В протоколе регистрируется дата гибели и возраст животного (в днях) на момент его гибели. Появление опухолей мо-

325

В. Н. Анисимов

лочных желез и других видимых новообразований у мышей, а также патологических изменений регистрируется в протоколе (отмечается дата и срок обнаружения в сутках). Обнаруженную опухоль еженедельно измеряют штангенциркулем по максимальному диаметру и отмечают максимальный диаметр (в см) на специальной схеме.

Потребление корма. Этот параметр измеряется ежемесячно на протяжении всего эксперимента. 10 г корма на 1 мышь помещают в контейнер для корма в клетке и через 24 ч взвешивают количество несъеденного корма, оставшегося в контейнере или на дне клетки. Результат регистрируется в г/мышь/сут.

Потребление воды также измеряется ежемесячно. В емкость наливается питьевая вода или раствор с тестируемым веществом в количестве 10 мл на мышь и измеряют потребление через 24 ч. Результат регистрируется в мл/мышь/сут.

Температура тела измеряется 1 раз в 3 месяца. Мышь фиксируется в обычном положении, сидящей на прутьях клетки с поднятым хвостом. Смо- ченный глицерином электрод электронного термометра вводят в прямую кишку на глубину 1 см. Первоначально температура может снижаться из-за стресса и ангиоспазма. Поэтому необходимо некоторое время выждать, пока мышь не успокоится и температура не стабилизируется.

Эстральная функция. Каждые 3 месяца в течение 3 последовательных недель ежедневно исследуются влагалищные мазки для идентификации стадий эстрального цикла (Nelson et al., 1982). Оцениваются следующие параметры: длительность каждого эстрального цикла (от первого дня эструса до первого дня эструса следующего цикла); соотношение фаз эстрального цикла, частота коротких, средних и длинных эстральных циклов (<5 дней, 5—7 дней, >7 дней); частота животных с регулярными и нерегулярными циклами; частота персистирующего эструса (в %).

Двигательная активность животных. Каждые 3 месяца исследуется двигательная активность мышей в тесте «открытое поле». Для этого животных каждой экспериментальной группы по одному помещают в пластиковую камеру размером 30 21 9 см, дно которой было расчерчено на квадраты 5 5 см: 5 квадратов по длине и 4 — по ширине. В течение 10 мин наблюдают за перемещениями мыши в «открытом поле» и фиксируют следующие параметры поведения:

1)количество пересеченных квадратов поля (квадрат считается пересе- ченным, если животное переступило его границу хотя бы двумя лапами),

2)число вертикальных стоек (животное поднимается на задние лапы),

3)длительность реакции груминга морды, тела и гениталий.

Для исключения ориентировочной реакции, связанной с запахами, после каждого животного пол камеры протирают влажной тряпкой. Тестирование проводится в возрасте 6, 9, 12 и 18 месяцев в дневное время в интервале с 10 до 17 ч.

Физическая сила и утомляемость. Исследования проводятся также каждые 3 месяца в дневные часы. Мышей подвешивают на струну, натяну-

326

Часть VI. Механизмы старения: демографические и теоретические аспекты

тую на высоте 75—80 см, так, чтобы они цеплялись передними лапами и висели на веревке до момента утомления и падения. Регистрируется время, через которое мыши перестают удерживаться на струне и падают. Через 20 мин мышей подвешивают второй раз и снова измеряют время до падения. Время выражают в секундах и находят среднее значение из двух показателей, высчитывают сумму, а также разницу между временем первого и второго падения, что может служить показателем восстановления сил. Кроме того, учитывая вес подвешиваемых животных, вычисляют отношение массы мыши ко времени ее первого и второго висения и времени висения к массе животного. Из этих показателей также находят среднее значение, сумму и разницу. В группах подсчитывают те же показатели, но уже по классам в зависимости от веса животных.

Патоморфологическое исследование. За животными наблюдают до их естественной гибели. Всех павших или убитых в состоянии крайней слабости животных вскрывают. На аутопсии осматривают кожу и все внутренние органы. При этом выявленные новообразования классифицируют согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака (МАИР) как «фатальные» (т. е. послужившие непосредственной причиной гибели животных) или как «случайные» (в случаях, когда животное погибло от других причин) (Gart et al., 1986). Все опухоли, а также ткани и органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, вырезают и фиксируют в 10 % нейтральном формалине. После рутинной гистологической обработки ткани заливают в парафин. Гистологические срезы толщиной 5—7 m окрашивают гематоксилином и эозином и изучают микроскопически. При диагностике опухолей используется гистологическая классификация опухолей, предложенная МАИР (Turusov, Mohr, 1994).

Параметры продолжительности жизни. При оценке динамики выживаемости рассчитывают среднюю продолжительность жизни (СПЖ) всех животных, а также 10 % максимально проживших мышей, медиану и максимальную продолжительность жизни (Михальский и др., 2007). При расче- те кинетических параметров популяционного старения используется модель Гомпертца для функции выживания:

где параметры a è b связаны с популяционной скоростью старения и на- чальной силой смертности соответственно. Параметр a часто характеризуется также величиной времени удвоения силы смертности (mortality rate doubling time, MRDT), рассчитываемой как ln(2)/a. Для анализа выживаемости используется метод Кокса (Cox, Oakes, 1996). Для каждой группы рассчитываются непараметрические оценки Каплана—Мейера условных функций дожития (Kaplan, Meier, 1958).

Статистика. При статистической обработке результатов опытов используются методы вариационной статистики с использованием пакета ста-

327

В. Н. Анисимов

тистических программ STATGRAPH. Рассчитываются параметры уравнения регрессии для кривых возрастной динамики веса тела. Достоверность различий оценивают по критериям t Стьюдента, непараметрическому критерию Вилкоксона—Манна—Уитни, точным методом Фишера или c2 (McKnight, Crowley, 1984; Taron, 1975). При оценке различий в частоте новообразований используется рекомендованный МАИР метод комбинированных таблиц контингентности, рассчитанных раздельно для фатальных и случайных опухолей с помощью программы CARTEST (Gart et al., 1986). При анализе выживаемости и риска развития опухолей используется лог-ранк тест (Cox, Oakes, 1996). Примеры применения различных современных подходов при статистической обработке результатов долгосрочных экспериментов приведены в книге «Геронтология in silico...» (2007).

Описанная методика тестирования была использована нами при изу- чении геропротекторной активности ряда фармакологических препаратов и веществ (мелатонина, антидиабетических бигуанидов, диабенола, эпиталамина, эпиталона, тималина, тимогена, вилона, нейронола, дельтарана, аквалена, янтарной кислоты и др.) (см. главу 12). Некоторые характеристики использованных в этих опытах мышей приведены в табл. 18.5 (см. главу 18).

19.5. КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ПРЕПАРАТОВ, УВЕЛИЧИВАЮЩИХ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ

Ты можешь ли не умереть, старик, И заменить октябрь цветущим маем?

Игорь Северянин

На первый взгляд, клинические испытания и утверждение показаний к препаратам, увеличивающим продолжительность жизни человека, является задачей, заведомо обреченной на неудачу, если вообще выполнимой. Поскольку такие лекарства должны назначаться вполне здоровым людям и в течение длительного срока, иногда на протяжении десятилетий, то очевидно, что к их безопасности должны предъявляться исключительно высокие требования. Прежде всего это касается побочных эффектов, вероятность развития которых должна практически быть нулевой. Если при таких испытаниях установлено снижение смертности, то будут необходимы длительные многолетние, даже в течение десятилетий, клинические исследования. Все это создает дополнительные трудности, поскольку в течение столь больших периодов времени могут изменяться как законодательство, касающееся патентных прав, так и регуляторные требования к самим испытаниям (Hefti, Bales, 2006). Важным аспектом проблемы являются этические требования к их проведению и вопросы стандартизации. Следует признать, что в настоящее время отсутствуют нормативные документы, регламентирующие про-

328

Часть VI. Механизмы старения: демографические и теоретические аспекты

ведение клинических испытаний препаратов, предназначенных для увели- чения продолжительности жизни человека (Warner, 2004).

Попытки оценить геропротекторное действие фармакологических препаратов или иных воздействий у людей весьма немногочисленны. В исследовании, выполненном L. Fontana и соавт. (2004), оценивалась эффективность ограничения калорийности питания у людей, соблюдавших такую диету в среднем в течение 6 лет, по сравнению с подобранными по возрасту и другим параметрам здоровыми людьми, придерживавшимися обычной американской диеты. Средний возраст 18 испытуемых был 50 10 лет (от 35 до 82 лет), все они не курили, не имели хронических заболеваний и не принимали гиполипидемических, антигипертензивных или других лекарств. Испытуемые потребляли ежедневно от 1112 до 1958 кКал. В их рацион входили фрукты, овощи, орехи, злаки, протеины и мясо. 26 % калорий они получали из белков, 28 % из жиров и 46 % из углеводов. Никто из них не употреблял сладкие напитки, закуски и десерт. Лица, вошедшие в контрольную группу (18 человек), потребляли 1976—3537 кКал в день и не имели никаких ограничений в сладком. В результате было установлено, что у лиц, придерживавшихся калорийно ограниченной диеты, был меньше вес тела, уровень общего холестерина, липопротеинов низкой плотности, триглицериды, глюкозы, инсулина, С-реактивного белка, тромбоцитарного фактора роста АВ (PDGF-AB), систолического и диастолического артериального давления, и выше уровень липопротеинов высокой плотности, чем в контрольной группе. Л. Хейфлик (1999) сообщил об эксперименте, проводившемся в те- чение 30 лет в Испании, при котором одной группе клинически нормальных людей, живших в доме престарелых, давали пищу с ограниченным числом калорий, а люди в контрольной группе питались, как обычно. Через 3 года в группе, потреблявшей ограниченное число калорий, болезни стали случаться в два раза реже и было зарегистрировано вполовину меньше смертей, чем в группе, которая питалась нормально.

Как показали исследования, выполненные в Институте геронтологии АМН Украины, удобным объектом для изучения эффективности геропротекторов являются люди с признаками ускоренного старения (Коркушко

èдр., 2002). По данным О. В. Коркушко и соавт. (2002) к такой категории могут быть отнесены лица, страдающие ишемической болезнью сердца. Авторы полагают, что ишемическая болезнь сердца является результатом ускоренного развития возрастных изменений сердечно-сосудистой системы

èорганизма в целом. В монографии О. В. Коркушко и соавт. (2002) приводится подробное описание методики оценки геропротекторного эффекта фармакологических препаратов на примере исследования пептидных препаратов тимуса и эпифиза. Эффективность препаратов оценивалась на основании динамики показателей субъективного состояния, функционального возраста физиологических систем организма, параметров физической и умственной работоспособности, иммунитета, костной ткани, обезвреживающей способности печени, липидного спектра крови, толерантности к углеводам, кислородного тканевого обмена, вегетативной регуляции и функционально-

329

В. Н. Анисимов

го состояния желез внутренней секреции. Важно отметить, что исследование выполнялось в течение 6—12 лет и критерием эффективности изученных в клинике препаратов тимуса и эпифиза явилось снижение смертности пациентов, получавших геропротекторы, при сравнении с группой контрольных пациентов (Коркушко и др., 2002, 2006).

19.6. МЕДИЦИНА АНТИСТАРЕНИЯ: МИФЫ И РЕАЛЬНОСТЬ

Что достигнуто? Я в дураках. Жизнь такая короткая!

Андрей Вознесенский

В последние годы все большее внимание ученых и специалистов привлекает проблема вмешательства в процесс старения. Проводится большое количество конференций и конгрессов, посвященных антистарению, издается огромное число научных и научно-популярных книг, появились специализированные научные журналы по этой проблеме, например Journal of Anti-Aging (недавно сменивший свое название на Rejuvenation Research), Journal of European Anti-Ageing Medicine and British Anti-Ageing Medical Journal и другие, издаются рассчитанные на широкую публику популярные журналы, рекламирующие различные средства для замедления старения. Появились очень активные общества, например Американская академия медицины антистарения, возглавляемая Робертом Клатцем (Robert Klatz), или Европейское общество антистарения, проводящие ежегодные конгрессы, собирающие многие тысячи участников. Все это свидетельствует как о возрастающем интересе общества в целом к проблеме постарения населения, так и определенном коммерческом успехе фармацевтических компаний, получающих баснословные прибыли от продажи разнообразных средств, рекламируемых как средства антистарения.

Вместе с тем в настоящее время отсутствуют доказательства, что воздействиями на процесс старения можно увеличить ожидаемую продолжительность жизни человека. С 1900 г., когда ожидаемая продолжительность жизни при рождении была 49 лет, к концу XX века в развитых странах она увеличилась на 27 лет (Crimmins et al., 1994; Minino et al., 2002). Такое же увеличение ожидаемой продолжительности жизни произошло за предыдущие 2000 лет истории человечества. Этот рост вызван значительным снижением смертности от детских инфекционных заболеваний и обусловлен повсеместным улучшением гигиены, изобретением антибиотиков и вакцин. В то же время хронические болезни, такие как сердечно-сосудистые, инсульт и рак, все еще остаются серьезной проблемой.

21 из 27 лет увеличения ожидаемой продолжительности жизни в ХХ веке имели место в его первые 70 лет, и только шестилетнее ее увеличение произошло за последнее трехлетие XX века (Crimmins et al., 1994; Minino

330