Флуоресцентные методы в ПЦР |
|||
Негибридизационные |
принцип |
||
|
|||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
|
– электрофорез |
|
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
|
Гибридизационные |
|
||
|
Гибридизация после амплификации |
варианты |
|
|
– прямая гибридизация |
||
|
Гибридизация во время амплификации |
• Фиксация : |
|
- biotin/strept. |
|||
|
|
||
|
|
• Подложка : |
|
|
|
- планшеты |
|
|
|
ДНК- |
|
Флуоресцентные методы в ПЦР |
||||
Негибридизационные |
|
принцип |
||
|
|
|||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
|
|
– электрофорез |
|
|
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
|
|
Гибридизационные |
|
|
||
|
Гибридизация после амплификации |
|
варианты |
|
|
– прямая гибридизация |
|
||
|
– обратная гибридизация |
• |
ДНК - "чипы" |
|
|
Гибридизация во время амплификации |
|||
|
|
|||
|
|
• возможность анализа |
||
|
|
мутаций по кривым |
||
|
|
плавления |
||
|
|
|
ДНК- |
|
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|||
Негибридизационные |
принцип |
||
|
|||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
|
– электрофорез |
|
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
|
Гибридизационные |
|
||
|
Гибридизация после амплификации |
варианты |
|
|
– прямая гибридизация |
||
|
– обратная гибридизация |
|
|
|
Гибридизация во время амплификации |
• Репортеры : FAM, HEX, TET |
|
•Тушитель (акцептор): TAMRA |
|||
|
– линейные зонды TaqMan® |
||
|
|
||
|
|
• Количественный анализ |
|
|
|
• Качественный анализ |
|
|
|
ДНК- |
|
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|||
Негибридизационные |
принцип |
||
|
|||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
|
– электрофорез |
|
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
|
Гибридизационные |
|
||
|
Гибридизация после амплификации |
варианты |
|
|
– прямая гибридизация |
||
|
– обратная гибридизация |
• Донор : FITC |
|
|
Гибридизация во время амплификации |
||
• Акцепторы: RED640, RED705 |
|||
|
– линейные зонды TaqMan ® |
• Анализ точечных мутаций |
|
|
– примыкающие зонды ("kissing probes") |
||
|
• Количественный анализ |
||
|
|
• Качественный анализ |
|
|
|
ДНК- |
|
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|||
Негибридизационные |
принцип |
||
|
|||
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
|
|
– электрофорез |
|
|
|
– метод "кривых плавления" |
|
|
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
|
|
– праймеры со "шпилькой" |
|
|
Гибридизационные |
|
||
|
Гибридизация после амплификации |
|
|
|
– прямая гибридизация |
варианты |
|
|
– обратная гибридизация |
||
|
|
||
|
Гибридизация во время амплификации |
• Репортеры : FAM, HEX, TET |
|
•Тушитель : DABCYL |
|||
|
– линейные зонды TaqMan ® |
||
|
|
||
|
– примыкающие зонды ("kissing probes") |
• Качественный анализ |
|
|
– зонды -"шпильки" ("beacons") |
• Количественный анализ |
|
|
|
ДНК- |
|
Флуоресцентные методы в ПЦР |
|
Негибридизационные |
|
|
Флуоресцентные интеркаляторы |
|
– электрофорез |
|
– метод "кривых плавления" |
|
Флуоресцентно-меченные праймеры |
|
– праймеры со "шпилькой" |
Гибридизационные |
|
|
Гибридизация после амплификации |
|
– прямая гибридизация |
|
– обратная гибридизация |
|
Гибридизация во время амплификации |
|
– линейные зонды TaqMan® |
|
– примыкающие зонды ("kissing probes") |
|
– зонды -"шпильки" ("beacons") |
|
ДНК- |
Основы «флуоресцентной» ПЦР
эффект переноса энергии (гашение флуоресценции)
5’-экзонуклеазная aктивность Taq-полимеразы
Основы «флуоресцентной» ПЦР
Варианты флуоресцентной ПЦР
Качественная |
Количественная |
(скрининг, идентификация) |
ответ: сколько |
ответ: ДА / НЕТ |
|
+
Терци |
Джин |
ДТ-322 |
к |
|
|
|
|
Кинетические кривые PCR
Стадия инициации |
(PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной |
|
меткой). |
Экспоненциальная стадия (наблюдается экспоненциальная зависимость
|
количества флуоресценции от цикла PCR). |
||||||
Плато |
(стадию насыщения). |
||||||
|
|
|
|
|
|
E |
n |
|
|
|
|
|
* |
|
|
|
|
|
|
P |
|
|
|
|
|
|
= |
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
P |
n |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|