Практическое занятие № 2

Тема: Выделение ДНК из крови

Цель занятия: Освоить метод выделения ДНК из крови ферментативным методом

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК из строго определенных субстратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки крови к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК из крови

Рисунок 8. ПЦР бокс

Материалы и обордование для проведения практического занятия.

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым откомпьютера управлением

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с» (Рисунок 8)

3. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

Ход работы:

Комплект реагентов предназначен для получения препарата нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из плазмы крови.

Лизирующий раствор (Tris Cl, pH 8.0; NaCl; SDS; Triton X-100; EDTA; H₂O)

Реагент для преципитации (ферментативный раствор)

Промывочный раствор №1 (органический раствор)

Промывочный раствор №2 (хлороформ)

Буфер для растворения

Внутренний контроль образца (Рисунок 9). Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологичекого материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.

Рисунок 9. Схема работы внутреннего контрольного образца

Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, Р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций "пришивают" участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Поставляемый в комплекте внутренний контрольный образец (ВК) представляет стабилизированную РНК и предназначен для использования с комплектом реагентов для амплификации.

1. Промаркируйте необходимое количество новых пробирок ёмкостью 1,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца (К-)

2. Внесите по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВК) в каждую пробирку (если предусмотрено его внесение)

3. Добавьте в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора, не касаясь края. Лизирующий раствор перед внесением в пробирки необходимо прогреть до 65⁰С

4. Добавьте в пробирки по 100 мкл исследуемого образца (кроме К-). В пробирки маркированные К-, добавьте 100 мкл отрицательного контрольного образца.

5. Плотно закройте крышки пробирок, перемешайте на вортексе в течение 3-5 сек

6. Термостатируйте пробу 15 мин при 65⁰С, осадите конденсат центрифугированием при 13000об\мин в течение 30 с.

7. Добавьте 400 мкл реагента для преципитации и перемешайте пробу на вортексе в течение 3-5 с.

8. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 15 мин

9. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

10. Добавьте к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5 раз аккуратно переверните пробирку

11. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 5 мин

12. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

13. Добавьте к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и 3-5 раз аккуратно переверните пробирку

14. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 5 мин

15. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

Контрольные вопросы:

1. Какое значение имеет внутренний контрольный образец?

2. Лизирующий раствор, назовите его функцию в процедуре выделения ДНК

3. Почему не целесообразно выделять ДНК уреаплазмаы (Ureaplasma urealyticum) из крови?

4. Какое значение приобретает ПЦР диагностика в современных клинико-диагностических лабораториях?