Введение
Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более известная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.
Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.
"Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала клеток, представленный в виде ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота), которые в свою очередь состоят из нескольких миллиардов нуклеотидов. Примечательно, если нить ДНК вытянуть, то ее длина составит около 2 метров. Но в составе клеточного ядра она настолько компактно свернута в спираль, что ее диаметр составляет сего лишь тысячную миллиметра.
ПЦР имитирует естественный процесс репликации (размножения) ДНК, в результате чего, в течение нескольких часов из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах.
В настоящее время ПЦР широко применяется в таких областях, как археология, судебная экспертиза, генетика, в определении отцовства, и особенно в медицине для диагностики инфекционных болезней.
ЛАБОРАТОРИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СЕГОДНЯ
Важнейшими особенностями современной клинической диагностики являются широкое использование высокоинформативных лабораторно-диагностических технологий и стремительное внедрение в практику здравоохранения новых лабораторных методов. Внедренные в клиническую практику в рациональных и обоснованных комбинациях, такие технологии значительно расширили, а в ряде случаев существенно изменили представления об этиологии и патогенезе многих известных заболеваний инфекционной, аутоиммунной и опухолевой природы. Более того, современная технологическая база предоставила врачу возможность оперативно вносить в лечебные схемы соответствующие редакции, что обеспечило более гибкий подход к разработке долгосрочных программ лечебно-реабилитационных мероприятий у больных с хронически-рецидивирующими, системными аутоиммунными и опухолевыми заболеваниями .
Современная система доказательной медицины выдвигает для врача-клинициста несколько задач:
постановка диагноза на основе полученных лабораторных или других диагностически значимых методов (скрининг);
контроль за лечением (мониторинг);
определение степени резистентности к схеме лечения;
контроль излеченности пациента и формирование прогноза.
Эти задачи на всех этапах призваны решать современные наукоемкие технологии, к которым принадлежит арсенал методов иммуно- и генодиагностики.
Краткая характеристики современных методов иммуно- и генодиагностики
РИФ
Метод РИФ основан на определении в составе анализируемого объекта радиоактивно меченных иммунных комплексов. Чаще всего применяется для идентификации инфекционных агентов, аутоантител, оценки иммунного статуса (субпопуляции лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток, маркеры активации, молекулы адгезии и др.)
ИФА
Метод ИФА-диагностики основан на инструментальной оценке взаимодействия комплексов иммунореагентов-антигенов и антител с использованием индикаторной ферментной метки. Этим методом, помимо традиционного использования в клинической биохимии для идентификации гормонов и ферментов, определяют антитела к различным инфекционным агентам, некоторым лекарственным препаратам, аллергенам, аутоантитела, общее содержание иммуноглобулина класса Е. Метод позволяет также определять и антигены, что особенно широко применяется при диагностике онкологических заболеваний при использовании ИФА-тестов на онкомаркеры. Большое значение для понимания тонких механизмов развития иммунной недостаточности и ассоциированных с ней заболеваний имеет определение с помощью ИФА уровня цитокинов и растворимых к ним рецепторов.
Методы клинической генодиагностики
Большие перспективы открывают методы молекулярной диагностики. Наиболее широкое клиническое применение из них нашла ПЦР-детекция нуклеотидного материала микроорганизмов путем многократного увеличения числа копий консервативных участков их генома. Среди основных нозологических категорий, входящих в сферу применения этих методов, - заболевания инфекционной природы, наследственные и опухолевые формы патологии и др. До недавних пор данные методы ограничивались детекцией медленнорастущих и труднокультивируемых микроорганизмов, что было в значительной степени обусловлено отсутствием адекватной лабораторной инфраструктуры и рядом технологических ограничений.
Благодаря достижениям последних лет в области биотехнологии, которые непосредственно касались используемых в специализированных лабораториях программ и форматов молекулярного тестирования (например, автоматическая экстракция нуклеиновых кислот, высокоскоростная полимеразная цепная реакция, детекция мишени), клиническая генодиагностика была преведена в разряд универсальных и многообещающих для изучения широкого круга этиопатогенов, включая вирусы и внутриклеточные микроорганизмы. В нозологическом отношении среди групп инфекционных заболеваний, подлежащих генодиагностике, следует особо выделить вирусные гепатиты, туберкулез, урогенитальные инфекции, герпетические и цитомегаловирусные менингоэнцефалиты, токсоплазмоз. Сегодня с помощью методов клинической генодиагностики можно определять типы возбудителей инфекционных заболеваний и в последующем оценивать их конкретную патогенетическую роль при формировании статуса острой или хронической формы инфекционного заболевания.
Современные принципы формирования программ комбинированного применения методов иммуногенодиагностики в клинической практике
Чтобы правильно разработать алгоритм обследования больного и интерпретировать результаты лабораторных исследований, врач-клиницист должен иметь представление об основных принципах методик, их преимуществах и недостатках.
Главные характеристики любого лабораторного метода - чувствительность и специфичность. Очевидно, что в идеале оба эти показателя должны приближаться к 100%. Но в реальной жизни они могут быть значительно ниже и существенно колебаться. Так, по данным Центра по контролю за заболеваниями (Атланта, США, 2000), показатели чувствительности и специфичности методов лабораторной диагностики инфекций, передающихся половым путем (ИППП), на основании анализов ряда лабораторий мира варьируют в следующих диапазонах: ПЦР - 80-95%, ИФА - 45-75%, РИФ - 20-70%.
Принимая во внимание актуальность и высокий уровень специфичности и чувствительности полимеразной цепной реакции далее работа будет посвящена методическому и практическому совершенствованию подготовки и проведения ДНК анализа.