6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 10.4. «Методы,* применяемые для видовой идентификации НТМБ»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план практического занятия

Цель практического занятия – формирование у слушателей современного представления о методах идентификации (базовых и новейших).

В ходе практического занятия рекомендуется разобрать:

•Методы, применяемые для идентификации представителей рода Mycobacterium (традиционные микробиологические, моле- кулярно-генетические)

•ДНК-стриповая технология

•Протеомный анализ методом масс-спектрометрии Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Ре-

комендуется использовать следующие методы: решение задач по выбору методов идентификации штаммов микобактерий, разбор ситуаций, которые могут возникнуть в лабораторной практике.

При разработке плана проведения практического занятия необходимо учитывать базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки, а также получаемые при прослушивании лекций и семинаров модуля 10. "Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий".

Вводная часть (5–10 мин)

Участникам предлагается информация на слайдах для того, чтобы они могли запомнить основное содержание, которое понадобится для отработки практических навыков.

Основная часть (30 мин)

Решение задач.

Задача 1.

Бактериологическая лаборатория ПТУ не имеет возможности проводить ПЦР-диагностику. Какие методы идентификации выросших культур микобактерий должны использоваться в этом случае?

Задача 2.

Нарисовать алгоритм работы с диагностическим материалом от момента его доставки в лабораторию до получения результатов

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

лекарственной чувствительности для лаборатории, которая использует систему BACTEC MGIT 960 и для которой закупают иммунохроматографические идентификационные тесты.

Задача 3.

На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена на 6-ой день инкубации в термостате была получена культура S-колоний цвета слоновой кости. После экспозиции на свету колонии приобрели ярко-желтый цвет. Какой вывод должен сделать врач и какие исследования провести с полученной культурой?

Задача 4.

При идентификации положительной пробирки с BACTEC MGIT 960 получены следующие результаты:

–ПЦР на выявление ДНК M.tuberculosis complex – положительна

–Посев на кровяной агар – положителен.

Какой вывод должен сделать врач и какие действия предпринять?

Задача 5.

При идентификации положительной пробирки с BACTEC MGIT 960 получены следующие результаты:

–ПЦР на выявление ДНК M.tuberculosis complex – положительна

–Посев на кровяной агар – отрицателен.

Какой вывод должен сделать врач и какие действия предпринять?

Задача 6.

При идентификации положительной пробирки с BACTEC MGIT 960 получены следующие результаты:

–ПЦР на выявление ДНК M.tuberculosis complex – отрицательна

–Посев на кровяной агар – положителен.

Какой вывод должен сделать врач и какие действия предпринять?

Задача 7.

При идентификации положительной пробирки с BACTEC MGIT 960 получены следующие результаты:

–ПЦР на выявление ДНК M.tuberculosis complex – отрицательна

–Посев на кровяной агар – отрицателен.

Какой вывод должен сделать врач и какие действия предпринять?

Задача 8.

Бактериологическая лаборатория на базе Центрального НИИ туберкулеза РАМН владеет всеми методами выявления и идентификации микобактерий. Распишите алгоритм работы (комплекс

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

методов), начиная от доставки диагностического материала от больного до получения результатов лекарственной чувствительности. В комплекс методов включите те, которые кажутся вам наиболее предпочтительными для задач выявления возбудителя и постановки ЛЧ. Объясните, почему вы выбрали именно эти методы.

Заключительная часть (5 мин)

Преподаватель еще раз фиксирует внимание слушателей на основных методах идентификации микобактерий и необходимости проведения идентификации в каждой противотуберкулезной лаборатории

Краткий информационный материал к практическому занятию Классические бактериологические методы идентификации НТМБ

1.Первичная идентификация по скорости роста на средах, цвету и морфологии колоний

2.Мазок со специфическим окрашиванием, выявляющим кислотоустойчивость бактерий (по Ziehl-Neelsen)

3.Посев на плотные яичные среды, содержащие селективные препараты (гидразид тиофен-2 карбоксиловая кислота, салицилат натрия, 5% NaCl, паранитробензойная кислота и т.д.)

4.Определение оптимума роста на плотных средах при разных температурах

5.Биохимические реакции: нитратредуктазный тест, тест на наличие термостабильной каталазы, тест на наличие пиразинамидазы и т.д.

Иммунохроматографический метод дифференцировки НТМБ от

микобактерий туберкулезного комплекса: основан на выявлении специфических детерминант белка MPT64, продуцируемого в культуральную среду M.tuberculosis complex

Высокоэффективная жидкостная хроматография: позволяет идентифицировать микобактерии до вида по жирным кислотам, входящим в состав клеточной стенки.

Идентификация микобактерий до вида с использованием масс-спектрометрии: идентификация микобактерий до вида основана на построении спектра рибосомальных белков, которые сильно отличаются от вида к виду, но консервативны в пределах одного вида.

Молекулярно-генетические методы и тест-системы для дифферен циации микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ

Секвенирование фрагментов генома. В результате процедуры секвенирования определяются видоспецифические последовательности генома микобактерий.

МОДУЛЬ 11. Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий

Тема 11.2. «Молекулярно* -генетические методы определения ЛУ МБТ»

Количество аудиторных часов – 2

Примерный план практического занятия

Входе практического занятия рекомендуется разобрать:

•Секвенирование генов МБТ, ответственных за устойчивость к ПТП

•Биочиповая технология

•ДНК-стриповая технология

•Аллель-специфическая ПЦР

Практическое занятие проводится в форме дискуссии на тему ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ молекулярно-генетическими методами. Практическое занятие рекомендуется разделить на 2 части, продолжительностью по часу, каждая из которых посвящена отдельной проблеме.

При разработке плана проведения практического занятия необходимо учитывать базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки, а также получаемые при прослушивании лекций и семинаров модуля 11. «Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» темы 11.2. «Молекулярно-ге- нетические методы определения ЛУ МБТ» семинарского занятия модуля 11 «Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» темы 11.2. «Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ».

Практическое занятие 1

Цель практического занятия – формирование у слушателей современного представления о методах детекции мутаций в геноме микобактерий, отвечающих за возникновение лекарственной устойчивости к ПТП, описание достоинств и ограничений каждого метода.

Вводная часть (5–10 мин)

Участникам предлагается информация на слайдах для того, чтобы они могли запомнить основное ее содержание, которое понадобиться для отработки практических навыков.

*Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Преподаватель описывает достоинства и ограничения каждого из трех методов молекулярно-генетического определения ЛЧ микобактерий туберкулеза, внедренных в работу практических противотуберкулезных лабораторий, проводя их сравнение

Заключительная часть (5 мин)

В заключении преподаватель подчеркивает, что для успешного решения задачи определения ЛЧ необходим комплексный подход, включающий и молекулярно-генетические методы, и традиционные микробиологические.

Краткий информационный материал к практическому занятию

Время проведения анализа

Самым быстрым методом из трех является аллель-специфиче- ская ПЦР, так как результат анализа возможно проанализировать непосредственно по окончанию реакции, не проводя фореза, гибридизации или еще одной стадии ПЦР.

Возможность работы непосредственно с диагностическим материалом

Вероятность контаминации

В протокол проведения анализа мутаций с помощью биологических микрочипов входит:

1.Двустадийная ПЦР, где продукты амплификации первой реакции являются ДНК-матрицей для второй реакции. Вероятность контаминации при работе с ампликонами очень велика.

2.Производители предлагают проводить визуализацию продуктов амплификации после каждой стадии ПЦР для контроля прохождения реакции. Электрофорез – наиболее контаминирую-

щий метод, так как работа ведется с ампликонами. ДНК-стриповая технология также предполагает работу с ам-

пликонами в открытых штативах-«ванночках», что может привести к контаминации.

ПЦР в режиме реального времени определяет накопление специфического продукта в закрытой пробирке непосредственно во время реакции, открытия пробирок с ампликонами не требуется.

Требования к помещениям лаборатории

Для проведения анализа мутаций с использованием микрочипов требуется несколько дополнительных помещений для профилактики контаминации: помещение для раскапывания второй стадии ПЦР и помещение для электрофореза

ДНК-стриповая технология тоже требует помещения для работы с ампликонами. Гибридизацию ампликонов на стрипах можно проводить в помещении электрофорезной или в специально выделенной комнате, не сообщающейся с «чистыми» помещениями.

Количество ПТП, к которым определяется чувствительность

Стоимость анализа

В табл. приведена стоимость одного анализа, рассчитанная из стоимости наборов от производителя. Цена наборов может ме-

Раздел 3. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

няться в зависимости от региона (доставка, компании-перекуп- щики и т.д.)

Возможность автоматизации процесса (для лабораторий с большим потоком анализов)

Практическое занятие 2

Цель практического занятия – формирование у слушателей представлений о комплексном подходе к определению ЛЧ микобактерий туберкулезного комплекса.

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий предлагает слушателям назвать критерии «идеальной» тест-системы для определения ЛЧ M.tuberculosis.

Основная часть (30 мин)

Слушатели разбиваются на 3 группы – «противотуберкулезные бактериологической лаборатории». Каждая группа должна дать краткую характеристику своей лаборатории – число анализов в год, число сотрудников, обеспеченность помещениями. Каждой группе предлагается выбрать и внедрить в своей «лаборатории» комплекс методов по определению ЛЧ. Слушатели должны описать методы и объяснить, на чем основывался их выбор.

Заключительная часть (5 мин)

В заключении преподаватель разбирает ошибки и дает оценку работы каждой группе слушателей.

Рекомендуемая литература

1.Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirzabekov A. Identification of rfampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips // J. Clin. Microbiol.

– 2001. – Vol. 39. – P. 2531–2540.

2.Smirnova, EY Nosova, OI Skotnikova, LN Chernousova, AM Moroz, AS Zasedatelev, and VM Mikhailovich. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to